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貨號：LE-1-387

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

莽草酸途徑是存在于植物、真菌和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶是莽草酸 合成途徑中的關(guān)鍵酶。

測定原理：

莽草酸脫氫酶催化莽草酸和 NADP 產(chǎn)生 NADPH，檢測 340nm 下的吸光值增加速率來表示 SD 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  石英比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

(1) 在試劑二中加入 25mL 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物 種）水浴 5min，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(2) 取 0.05mL 樣本和0.95mL 試劑二于 1mL 比色皿中，混勻，在 340 nm波長下立即記錄

20 秒時的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒時的吸光度 A2，計算 ΔA=A2-A1。

SD 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。 

SD（nmol /min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V×樣 Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

SD（nmol /min /g  鮮重） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=643×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘每分鐘產(chǎn)生 1  nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

SD（nmol /min /10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。