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主要用途

GENMED組織蛋白磷酸酶1（PP1）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性底物糖原磷酸化酶a，在PP2A抑制劑存在下，受到PP1去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，即采用比色法測(cè)定單位酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種組織裂解懸液樣品包括免疫沉淀復(fù)合物和粗提或部分純化酶樣品的蛋白磷酸化酶1活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

蛋白磷酸化酶1（protein phosphatase 1；PP1；EC 3.1.3.48），又稱為1型蛋白絲/蘇氨酸磷酸化酶，是7個(gè)主要絲/蘇氨酸磷酸化酶（包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP4、PP5、PP6）成員之一，從酵母到人類高度進(jìn)化保留。其參與調(diào)節(jié)多種重要的細(xì)胞生理功能，包括糖原代謝、細(xì)胞分裂、肌肉收縮、信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)元功能、轉(zhuǎn)錄、翻譯等，以及與HIV-1轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)，并且與老年性癡呆等多種疾病密切相關(guān)。PP1分子結(jié)構(gòu)表面的3個(gè)凹槽及β 12-β 13 Loop環(huán)結(jié)構(gòu)，是底物與抑制劑的結(jié)合部位；其催化亞體為37kd，調(diào)節(jié)亞體有2種：目標(biāo)亞體和抑制亞體?；谔禺愋缘孜锾窃姿峄?/span>a，在PP2A抑制劑福司曲星（fostriecin；FOS）存在的情況下，受到蛋白磷酸化酶1的去磷酸化作用，釋放出游離磷酸根，由硫酸亞鐵氨還原產(chǎn)生鉬藍(lán)顯色反應(yīng)后峰值的變化，測(cè)定蛋白磷酸酶1的單位酶活性 

產(chǎn)品內(nèi)容 

GENMED清理液（Reagent A）  毫升

GENMED裂解液（Reagent B）    毫升

GENMED緩沖液（Reagent C）  毫升

GENMED陰性液（Reagent D）    毫升

GENMED反應(yīng)液（Reagent E）  微升

GENMED顯色液（Reagent F）  毫升

GENMED標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）  微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存GENMED裂解液（Reagent B）、GENMED緩沖液（Reagent C）、GENMED反應(yīng)液（Reagent E）和GENMED顯色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；有效保證6月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

平式搖蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

500微升1厘米光徑比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、 樣品準(zhǔn)備 

1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量

2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管

3． （選擇步驟）加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A）清洗1次

4． 移入到一個(gè)液氮凍存管

5． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜

6． 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）

7． 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管

8． 加入預(yù)冷的xx微升GENMED裂解液（Reagent B） 

9． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

10． 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻

11． 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/span>

12． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

14． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

15． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如組織裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）

2． 設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零  

3． 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管

4． 按下表分別加入GENMED陰性液（Reagent D）和GENMED標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）到每個(gè)離心管，混勻

5． 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

1． 移取200微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到新的比色皿

2． 在30℃溫度下孵育10分鐘

3． 加入xx微升GENMED顯色液（Reagent F），混勻

4． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

5． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

6． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至5四次

7． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

四、 樣品背景測(cè)定

1． 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白；作為樣品背景） 

3． 在30℃溫度下孵育10分鐘

4． 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent D），混勻

5． 加入xx微升GENMED顯色液（Reagent F），混勻

6． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

8． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

五、 樣品活性測(cè)定

1． 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入20微升待測(cè)樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白） 

3． 在30℃溫度下孵育2分鐘

4． 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）

5． 在30℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent D），混勻

7． 加入xx微升GENMED顯色液（Reagent F），混勻

8． 在37℃溫度下孵育10分鐘，避免光照

9． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

10． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

六、 計(jì)算樣品活性

七、酶標(biāo)儀測(cè)定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品背景、樣品活性

2． 分別移取100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品孔里

3． 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到樣品背景和待測(cè)樣品孔里

4． 分別加入10微升待測(cè)樣品（總量100微克組織裂解萃取液蛋白）到樣品背景和樣品活性孔里

5． 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent E）到樣品活性孔里

6． 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent D）到樣品背景孔里

7． 在30℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM

8． 分別加入xx微升GENMED陰性液（Reagent D）到樣品背景和待測(cè)樣品孔里

9． 分別加入xx微升GENMED顯色液（Reagent F）到所有孔里

10． 在37℃溫度下，置于平式搖蕩儀孵育10分鐘，速度為50RPM，避免光照

11． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)

12． 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

13． 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）

14． 計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為25次操作，包括5次（點(diǎn)）標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定只需1條

4． GENMED顯色液（Reagent F）具有腐蝕性，避免直接用手接觸

5． 樣品切忌使用磷酸緩沖液、EDTA、EGTA和脫氧膽酸納處理

6． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底

7． 如果用戶沒有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代

8． 吸光讀數(shù)增高，表明具有酶活性

9． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/20微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

10． 蛋白磷酸酶1活性單位濃度定義：在30℃溫度下，pH 7.4的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷

11． 本公司提供系列磷酸化酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確

使用承諾

秉著“信譽(yù)至上、客戶滿意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品和服務(wù)。用戶收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說明書上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說明書所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問題，請(qǐng)立即以書面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）與本公司聯(lián)系，并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

訂購信息

單組分訂購信息

編號(hào) 名稱 規(guī)格

GMS50313.2 GENMED組織蛋白磷酸酶1活性比色法定量檢測(cè)試劑盒 20次

GMS50313.2A GENMED清理液（Reagent A）     毫升

GMS50313.2B GENMED裂解液（Reagent B）      毫升

GMS50313.2C GENMED緩沖液（Reagent C）     毫升

GMS50313.2D  GENMED陰性液（Reagent D）      毫升

GMS50313.2E  GENMED反應(yīng)液（Reagent E）       毫升

GMS50313.2F  GENMED顯色液（Reagent F） 毫升

GMS50313.2G  GENMED標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G） 毫升

GMS30030.1 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 200次

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