產(chǎn)品名稱:肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)測試盒
產(chǎn)品規(guī)格:50管/48樣,100管/96樣
產(chǎn)品貨號(hào):LE-1-153,LE-2-153
免費(fèi)咨詢:0551-66107970
貨號(hào) |
產(chǎn)品名稱 |
檢測方法 |
規(guī)格 |
售價(jià)(元) |
LE-1-153 |
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)測試盒 |
分光光度法 |
50管/48樣 |
1500 |
LE-2-153 |
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)測試盒 |
微量法 |
100管/96樣 |
2800 |
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(CPT1)測試盒說明書(分光光度法)
貨號(hào):LE-1-153
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類?;D(zhuǎn)移酶。可逆地催化從?;o酶 A 將?;D(zhuǎn)移至 L-肉毒堿的反應(yīng),在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過線粒體內(nèi)膜的過程中起重要作用。
測定原理:
基于肉堿和脂酰輔酶 A 在丙二酰輔酶 A 存在與否的條件下,通過肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用,產(chǎn)生脂酰肉堿,并釋放出巰基輔酶 A(COA-SH),與 Ellman 試劑 DN-TB 反應(yīng)后,產(chǎn)生黃色的 TNB。通過其吸收峰值得變化(412nm),來定量分析 CPT-1 的活性。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體 50mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑二:液體 10mL×1 瓶,-20℃保存;
試劑三:液體 1mL×1 支,-20℃保存;
試劑四:液體 55mL×1 瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1 瓶,4℃保存;
試劑六:粉劑×1 支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
① 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞,加入 1mL 試劑一和 10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿液于 600g,4℃離心 5min。
③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。
④ 上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的 CPT-1(此步可選做)。
⑤ 在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超聲 3 秒,間隔 10 秒,重復(fù) 30 次),用于線粒體 CPT-1 測定。
測定步驟:
1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 412nm,蒸餾水調(diào)零。
2、樣本測定
① 在試劑五中加入 2mL 無水乙醇,混勻,再加入 44mL 試劑四,混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)孵育 5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
② 在試劑六中加入 2mL 蒸餾水,混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)孵育 5min;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融;
③ 在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 樣本、880μL 試劑五和 40μL 試劑六,混勻,記錄 412nm 處 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2,計(jì)算 ΔA=A2-A1。
CPT-1 活性計(jì)算:
(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算:
單位的定義:每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計(jì)算:
單位的定義:每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=177.8×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
單位的定義:每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。
CPT-1(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.3556×ΔA
V 反總:反應(yīng)體系總體積,9.6×10-4 L;ε:TNB 摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V 樣:加入樣本體積,0.04 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T: 反應(yīng)時(shí)間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬。
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