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肉桂酸-4-羥化酶(C4H)測試盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-210

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

C4H 又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌類中，該酶催化肉桂酸羥 化作用產(chǎn)生 4-香豆酸鹽，是苯丙烷途徑中繼 L-苯丙氨酸解氨酶之后的第二個關(guān)鍵酶。

測定原理：

C4H 催化肉桂酸和 NADP 生成 4-香豆酸鹽和 NADPH，在 340nm 下測定 NADPH 生成速率， 即可反映 C4H 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）取試劑二一瓶，加入 25mL 試劑一充分溶解混勻，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h 內(nèi)用完）；

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2 ，計算ΔA=A2-A1。

C4H 活性計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=643×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個酶活力單位。

C4H（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d） ×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε ：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。