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多胺氧化酶（PAO）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-184

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

多胺氧化酶是催化生物體內(nèi)多胺氧化的關(guān)鍵酶，通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)多胺水平和生成物的濃度，參與各種植物體對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

測(cè)定原理：

PAO 催化多胺氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫，在過(guò)氧化氫酶存在的條件下與底物顯色，在 550nm 下有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值增加速率來(lái)反映 PAO 活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 3mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

PAO 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A550 變化 0.002 為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.002÷T

=166.67×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A550 變化 0.002 為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.002÷T

=166.67×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A550 變化 0.002 為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.002÷T

=0.333×ΔA

4、按液體體積計(jì)算

單位的定義：每 mL 液體樣本在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A550 變化 0.002 為一個(gè)酶活力單位。

PAO（U/mL）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.002÷T

=166.67×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。