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肉桂醇脫氫酶（CAD）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-388

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

CAD 是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最后一步，催化多種不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于 高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī) 理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

測定原理：

CAD 催化肉桂醇和 NADP 生成肉桂醛和 NADPH ，在 340nm 下測定 NADPH 生成速率，即 可反映 CAD 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 

試劑一：液體 60mL×1 瓶，  4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）在試劑二中加入 25mL 試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物 種）水浴 5min； 現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 24h 內(nèi)用完）；

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和950μL 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處初 始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2 ，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

CAD 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

CAD（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/g  鮮重） ＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=643×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

CAD（nmol/min/10⁴ cell） ＝[ΔA×V 反總÷  (ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1.286×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。