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單寧酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-181

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解沒食子酸單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖。

測(cè)定原理

使用抗氧化劑沒食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，在 270nn 下測(cè)定底物 PG 反應(yīng)前后的光密度變化,計(jì)算單寧酶酶活力。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰、蒸餾水

試劑的組成和配制

試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；臨用前每支加入 3mL 試劑一，充分溶解后備用；用不完的試劑 4℃保存；

粗酶液提取

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 270 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表

注意：可以在不同對(duì)照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集中進(jìn)行 5min 95℃沸水浴處理。

TAN 活力單位的計(jì)算

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸方程為 y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x 為 PG 含量（μmol/L），y為吸光值。

1、按樣本體積計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫升粗酶液每分鐘水解減少 0.01μmol 底物 PG 所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位。

TAN 活性(μmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反總÷0.01÷V 樣÷T

=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：40℃下每毫克蛋白每分鐘水解減少 0.01μmol 底物 PG 所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN 活性((μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反總÷0.01÷(V 樣×Cpr)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：40℃下每克樣品每分鐘水解減少 0.01μmol 底物 PG 所需要的酶量定義為一個(gè)酶活單位(U)。

TAN 活性(μmol/min/g  鮮重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反總÷0.01÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

=34.48×(ΔA-0.0044）÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL； V 樣：加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。