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天冬酰胺合成酶測試盒檢測試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-313

天冬酰胺合成酶是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類氨基轉(zhuǎn)移酶，催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸轉(zhuǎn)移。當(dāng)植物處于氨毒時(shí)天冬酰胺的形成是一種解毒反應(yīng)。

測定原理：

AS催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計(jì)算其酶活性。

需自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，4 ℃避光保存；臨用前每瓶加入 12.5mL 蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用；

試劑三：液體 30 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑四：液體 10 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑五：液體 6 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑六：液體6 mL×1瓶，常溫避光保

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g  4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在 EP 中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴 1 小時(shí)

混勻，8000 g，25℃離心 10 min；取上清液，在 EP 管中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min，420nm 處讀取吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測定管-A 對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管

注意：

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A 測定管-A 對(duì)照管）若出現(xiàn)負(fù)值，可能是酶活性較低，可將反應(yīng)時(shí)間 1h 延長到 2h，相應(yīng)的在計(jì)算公式中除以 2。

酶活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y =3.8488x +0.0057，R2  = 0.9983；；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y 為吸光值 A。

1、血清（漿）AS 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

AS（nmol /min /mL）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷V 樣÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 AS 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每 mg 蛋白質(zhì)每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

AS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每 g 組織每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol  氨定義為一個(gè)酶活力單位。

AS（nmol/min/g 鮮重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000

=181.8×(ΔA -0.0057)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol  氨定義為一個(gè)酶活力單位。

AS（nmol/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T×1000

=0.3637×(ΔA-0.0057)

V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.05mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬; 1000，μmol 到 nmol 換算系數(shù)。