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α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Af）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-122

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類，使細胞壁阿拉伯半乳聚糖、 阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進果膠的增溶和降解。由于果實成熟過程中常常伴隨 著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實成熟軟化中的研究具有重大意義。

測定原理：

α-L-Af 分解對硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm有最大吸收峰，通過 測定吸光值升高速率來計算α-L-Af 活性。

自備用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶， -20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進行冰浴勻漿。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃準確水浴 30min

充分混勻，400nm 處測定吸光值 A，計算 ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

α-L-Af活性計算：

標(biāo)準條件下測定的回歸方程為 y =0.00585x -0.0027；x 為標(biāo)準品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每 min 產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每小時產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中 樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；W：樣本質(zhì)量，g；  500：細胞或細 菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。