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貨號：LE-1-224

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α ， α- 1- 1  糖苷鍵連接而成的一種非還原雙糖， 廣泛存 在于細(xì)菌、酵母菌、霉菌、食用菌、低等植物、昆蟲、 無脊椎動(dòng)物和高等植物等多種有機(jī)體 中。 海藻糖的非還原性決定了它對酸、堿、高溫等的穩(wěn)定性。另外， 它本身具有很強(qiáng)的吸水 性，使它在生物體內(nèi)具有抗脫水作用，在逆境條件下可通過識別外界刺激、產(chǎn)生和傳遞信號、 基因表達(dá)和代謝調(diào)節(jié)來保護(hù)植物免受不良環(huán)境的傷害。

植物體內(nèi)主要以葡萄糖為底物合成海藻糖，該反應(yīng)首先在海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase ，TPS)的作用下，催化尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)和 6- 磷酸葡萄糖反應(yīng)生成中間產(chǎn)物6-磷酸海藻糖， 再在海藻糖-6-磷酸磷酸酶  (trehalose   6-phosphate phosphatase ，TPP)的作用下去磷酸化，生成海藻糖。因此，測定TPS活性對于 研究植物逆境具有重要意義。

測定原理：

TPS 催化 UDPG 與 G6P 生成海藻糖-6-磷酸，同時(shí)產(chǎn)生 UDP；UDP 在丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化 NADH 為 NAD+，NADH 的下降速率與 UDP 含量成正比，通過 340nm吸光度下降速率反映 TPS 活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 

試劑的組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶， -20℃保存； 臨用前加入 10mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝后-20℃ 保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑二：粉劑×2 瓶， -20℃保存；臨用前每瓶加入 25mL 試劑五溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用；

試劑三：粉劑×1 瓶， -20℃避光保存；臨用前加入 0.1mL 試劑五溶解，用不完的試劑分裝后 -20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑四：100μL×1 瓶， 4℃避光保存；臨用前低速離心，以防止試劑沾在管壁； 

試劑五：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

工作液的配制：臨用前， 先配置好 1 瓶試劑二和試劑三， 然后在試劑二瓶中加入 25μL 試劑 三和 25μL 試劑四， 充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 (10⁴ 個(gè))： 提取液體積(mL)為 500~1000 ：1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液)， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù) 30 次) ；8000g ，4℃離心 10min ，取上清， 置冰上待測。

2、組織的處理： 按照組織質(zhì)量(g) ：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例(建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 提取液) ，冰浴中勻漿。 8000g  ，4℃離心 10min ，取上清， 置冰上待測。 

測定步驟

1、在 EP 管中加入如下試劑

混勻， 30℃反應(yīng) 20min ，95℃水浴 2min 滅活， 冷卻至室溫。10000g 4℃離心 5min，取上層 反應(yīng)液待測。

2、工作液配制： 詳見試劑的組成和配制中工作液的配制。

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入如下試劑

混勻，測定 340nm 下 5min 后吸光值 A1 與 10min 后吸光值 A2 ，ΔA=A1-A2。

TPS 活力計(jì)算：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPS 活力(nmol/min/mg prot)=ΔA×V 反總÷  (ε×d) ×10⁹÷ (V 樣×Cpr) ÷T×3 =643×ΔA ÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPS 活力(nmol/min/g  鮮重)=ΔA×V 反總÷  (ε×d) ×10⁹÷ (W× V 樣÷V 樣總) ÷T×3 =643×ΔA÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

TPS 活力(nmol/min/10⁴ cell)=ΔA×V 反總÷  (ε×d) ×10⁹÷ (V 樣×細(xì)胞數(shù)量) ÷T×3 = 1.28×ΔA

V  反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)， 6.22×10³ L / mol /cm；d：比色 皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積， 0.15 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL；T：反應(yīng) 時(shí)間， 5  min；3，稀釋倍數(shù)；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量；細(xì)胞數(shù)量， 500 萬。