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脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）試劑盒說明書（分光光度法 ） 

貨號：LE-1-279

測定意義：

DHAR 存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中。DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA 和 GSSG， 調(diào)控細(xì)胞 AsA/DHA 比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶。提高植物體內(nèi)的 DHAR  活性，可提高植物食品中 AsA 含量，進(jìn)而提高植物食品的營養(yǎng)品質(zhì)。

測定原理：

DHAR 催化 GSH 還原 DHA 生成 AsA ，通過測定 DHA 減少速率，計(jì)算 DHAR 活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50 mL× 1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 35 mL× 1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑× 1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑× 1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

1.    按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 10min ，取上清置冰上待測。

2.  細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，

總時間 3min）；8000g 4℃離心 20min ，取上清液置冰上混勻待測。

3.    血清等液體：直接測定。

DHAR 測定操作：

1.  分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長到 265nm ，蒸餾水調(diào)零。

2.  試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3.  在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 試劑三、100μL 試劑四和 700μL  試劑二，最后加 100μL 上清液，迅速混勻后于 265nm 比色，記錄 30s 和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A2-A1。 

DHAR 活性計(jì)算公式：

1、按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成 1nmol AsA  為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d ×V 反總× 10⁹÷(Cpr×V 樣)÷T= 92×△A ÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA  為 1 個酶活單位。 

DHAR(nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d ×V 反總× 10⁹÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T= 92× △A ÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個細(xì)胞每分鐘還原生成 1nmol AsA  為 1 個酶活單位。 

DHAR(nmol/min/ 10⁴ cell) = △A÷ε÷d ×V 反總× 10⁹÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T= 92× △A ÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成 1nmol AsA  為 1 個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d ×V 反總× 10⁹÷V 樣÷T= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 處摩爾吸光系數(shù)為 5.42× 10⁴  L/mol /cm；109：摩爾分子換算成納摩爾分子； d：比色杯光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；V 樣：反應(yīng)體系中加入上 清液體積，100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL； W ，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2 min。

注意事項(xiàng)：臨用前配制的試劑未使用完的 4℃保存，3 天內(nèi)使用完。