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L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-275

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

L-半乳糖途徑是合成 AsA 的主要途徑。GalLDH 位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi) AsA  生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對植物體內(nèi)AsA 含量的積累起著至關(guān)重 要的作用。

測定原理：

Gal LDH 催化 L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞色素 c（Cyt c），還原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰；測 定還原型 Cyt c 增加速率，來計算 GalLDH 活性。

自備儀器和用品：

臺式離心機(jī)、可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 40mL 蒸餾水，充分溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水，充分溶解。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g ，4℃離心 10min ，取上清置冰上待測。

Gal LDH 測定操作：

1、分光光度計預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長到 550nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3、依次在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 預(yù)熱的試劑二和 100μL 試劑三，迅 速混勻后于 550nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2 ，△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性計算公式：

1、按蛋白濃度計算

GalLDH 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原 1μmol Cyt c 為 1 個酶活單位。

Gal LDH (μmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁶÷（Cpr×V 樣）÷T 

=289×△A ÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

GalLDH 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原 1μmol Cyt c 為 1 個酶活單位

Gal LDH (μmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁶÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

=289×△A ÷W

ε：還原型 Cyt c 摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/ mol/cm；d：比色皿光徑(cm) ，1cm；V 反總：反 應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L；10⁶ ：1mol=1×10⁶μmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積， 100μL=0. 1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL ，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公 司蛋白質(zhì)含量 BCA 試劑盒；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W ，樣本質(zhì)量，g；T ：反應(yīng) 時間，2min。

注意事項:

試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。