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貨號：LE-1-248

正式測定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定                                           

測定意義：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase, PPDK, EC 2.7.9.1）是 C4 途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化 ATP、丙酮酸和 Pi 經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于 C4 植物的葉綠體基質(zhì)中，對光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PPDK 的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸、AMP 和 PPi 生成丙酮酸、ATP 和 Pi，乳酸脫氫酶進(jìn)一步催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD⁺，在 340nm 測定 NADH 減少速率，計(jì)算PPDK 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60 mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保存；

試劑三 ：液體 60μL×1 支，4℃保存；體積較少，若沾在管壁上，臨用前可低速離心后使用。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟和加樣表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）工作液的配制：臨用前取試劑二一瓶加入 25mL 試劑一和 12.5μL 試劑三，充分混勻， 置于 37℃水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

（2）在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本和 950μL 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 37℃反應(yīng) 5min 后的吸光值 A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

PPDK 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=643×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。