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吲哚乙酸氧化酶活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-389

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。植物體內(nèi)吲哚乙酸氧化酶活力的大小，對調(diào)節(jié)體內(nèi)吲哚乙酸的水平，起著重要的作用，而影響植物的生長。

測定原理：

在無機(jī)酸存在情況下，吲哚乙酸能與 FeCl3作用，生成紅色螯合物，該物質(zhì)在530nm 處有最大吸收峰，酶活力的大小可以其破壞吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法測定。

自備儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、1.5mL 離心管、微量玻璃 比色皿/96 孔板、和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 65mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑五：液體 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑六：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。臨用前吸取 1mL 試劑五加入試劑六中混勻，待用，避光保存

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g ，4℃離心 10min ，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g ，4℃ ,離心 10min ，取上清置于冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

測定操作：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min ，調(diào)節(jié)波長到 530 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二、試劑三、試劑四置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫 20min。

3、取 1.5mL EP 管若干，操作表如下：

注意：標(biāo)準(zhǔn)管只需做一次

IAA 氧化酶活性計(jì)算公式：

a.  使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 1.334x + 0.025  R² = 0.998（x 為 IAA 濃度，mmol /L；y 為吸光值）

1、按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：從開始時(shí)加入的 IAA 量減去酶作用后殘留的IAA 含量，即得被酶所催化的 IAA 含量。以每mg 酶蛋白在 1h 內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/mg prot）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 樣÷（V 樣×Cpr÷T 

= 1.5×（A1-A2）÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

酶活定義： 以每 g 樣本在 1h 內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/g  鮮重）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T

= 1.5×（A1-A2）÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義： 以每 1 萬個(gè)細(xì)胞在 1h 內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/10⁴ cell）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334]×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T 

= 1.5×（A1-A2）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

酶活定義： 以每mL 酶液在 1h 內(nèi)分解破壞的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U (μmol/h/mL）=[(A1-0.025)÷ 1.334-(A2-0.025)÷ 1.334] ×V 樣÷(V 樣÷V 樣總) ÷T 

= 1.5×（A1-A2）

V 樣總：上清液總體積，1mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02 mL；Cpr： 上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g ，T ：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。

注意事項(xiàng)：

最低檢出限為 0.01μmol/mL。