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貨號：LE-1-219

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

MDH （EC 1.1.1.37）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，線粒體中 MDH 是 TCA 循環(huán)的關鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中 MDH 催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物，  連接多條重要的代謝途徑。因此 ，MDH  在細胞多種生 理活動中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、 蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧 代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH 分為 NAD-依賴的 MDH 和 NADP-依賴的 MDH，細菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核細胞中，NAD-MDH 分布于細胞質(zhì)和線粒體中。

測定原理：

MDHm 催化 NADH 還原草酰乙酸生成蘋果酸，導致 340nm 處光吸收下降。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸餾水。 

試劑的組成和配制：

試劑一： 液體 50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二： 液體 10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三： 液體 1mL×1 支 ，-20℃保存；

試劑四、液體 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；

試劑五、粉劑×2 支，-20℃保存； 臨用前加入 300μL 蒸餾水，充分溶解待用 ；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

試劑六、粉劑×2 支，-20℃保存； 臨用前加入 300μL 蒸餾水，充分溶解待用 ；用不完的試劑 分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。

樣本測定的準備：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1mL 試劑一和 10uL  試劑三 ，用冰浴勻漿器 或研缽勻漿。

2、將勻漿液于 600g，4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中， 11000g，4℃離心 10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的 MDH（此步可選做）。

5、在步驟 ④ 中的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL  試劑三 ，超聲波破碎（冰浴，功率 20% 或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體 MDH 測定。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑四在37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，混勻后立即在 340 nm 波長下記錄初始吸光度 A1 和反應 1min 后的吸光度 A2，計算 ΔA=A1-A2。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。

MDHm 活力單位的計算：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=6430×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/g  鮮重）=[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T

=1299×ΔA÷W

3、按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個酶活力單位。

MDHm（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷（2000×V 樣÷V 樣總）÷T

=0.65×ΔA

V 反總：反應體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積 ，0.202 mL； T：反應時間， 1 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；2000：細胞或細 菌總數(shù)，2000 萬。