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羥甲基戊二酰輔酶 A 合成酶（HMGCS）試劑盒說明書（分光光度法 ）

貨號：LE-1-220

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

羥甲基戊二酰輔酶 A 合酶是甲羥戊酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶 ，催化乙酰 CoA  與乙酰乙酰 CoA 生成羥甲基戊二酰 CoA。

測定原理

HMGCS 催化乙酰 CoA 與乙酰乙酰 CoA 生成羥甲基戊二酰 CoA，同時產(chǎn)生 CoASH，使 DTNB 轉(zhuǎn)化為黃色的 TNB，在 412nm 下有特征吸光值。

所需的儀器和用品

可見分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、 1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶， -20℃避光保存；臨用前加入 7mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑二：粉劑×1瓶， -20℃避光保存；臨用前加入 7mL 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

試劑三：15mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣本測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量  （104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、在 1 mL 玻璃比色皿中加入 125μL 試劑一、125μL 試劑二和 250μL 試劑三，混勻，加入 500μL 樣本上清，迅速混勻后記錄 412nm下初始吸光值 A1 和 4min 后的吸光值 A2。計 算 ΔA ＝A2-A1。

HMGCS 活性計算

1、血清（漿）活性

單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位。 

HMGCS（nmol/min /mL）=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 樣 ÷T

=36.76×ΔA

2、組織、細菌或細胞 HMGCS 活性

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=36.76×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷( ε×d）×10⁹]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T

=36.76×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmolTNB 為一個酶活力單位。

HMGCS（nmol/min /10⁴ cel）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T

=0.074×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε： TNB 摩爾消光系數(shù)， 1.36×10⁴ L / mol /cm； d：比  色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.5  mL；V 樣總：加入提取液體積， 1mL；T：反  應(yīng)時間，4 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)， 500 萬。