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乙酰乳酸合成酶（ALS）試劑盒說(shuō)明書(shū)(微量法)

測(cè)定意義：

乙酰乳酸合成酶（Acetolactate Synthase），存在于植物生長(zhǎng)過(guò)程中，它能以高度專一性和極 高的催化效率催化丙酮酸為乙酰乳酸，從而影響支鏈氨基酸的生物合成。

測(cè)定原理：

ALS催化丙酮酸生成乙酰乳酸，乙酰乳酸在一定條件下脫羧生成乙偶姻，乙偶姻在堿性環(huán)境下與肌酸和α-萘酚反應(yīng)生成紅色物質(zhì)，在 525nm 下有最大吸光值。 

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、硫酸銨、冰和蒸餾水。 

試劑的組成和配制：

緩沖液：100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1瓶， -20℃避光保存；臨用前加入 60mL 緩沖液充分溶解，用不完的試劑-20℃ 避光保存。

試劑二：30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×1瓶， -20℃避光保存；臨用前加入 12mL 緩沖液溶解待用，用不完的試劑-20℃ 避光保存；

試劑四：1.5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：6mL×1 瓶，4℃保存；

試劑六：粉劑×2 瓶， 4℃避光保存；臨用前加入 3mL 試劑七溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑七：10mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液的提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：2~4 的比例（建議稱取約 0.5g 到 1g 組織，加入 試劑一定容至 2mL），進(jìn)行冰浴勻漿。17000g  4℃離心 20min 。取 1mL 上清，轉(zhuǎn)移至新的 EP 管。

在取出的上清中加入約 0.5g 硫酸銨，充分溶解后 4℃靜置 2h。然后 17000g    4℃離心 20min，棄掉上清。沉淀中加入 0.5mL 試劑二，充分溶解待用。用不完的樣本-20℃保存。

測(cè)定步驟：

在 EP 管中加入如下試劑

充分混勻，60℃反應(yīng) 15min，然后取 200μL 于 96 孔板中，測(cè)定 525nm 處初始吸光值 A 測(cè)定與 A 對(duì)照。ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。

ALS 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 0.2438x - 0.0096 ，R²  = 0.997；其中 x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/mL,y 為吸光值 ΔA

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的乙酰乳酸定義為一個(gè)酶活力單位。

ALS（nmol /min/mg prot）=  (ΔA+0.0096）÷0.2438×V 樣÷(V 樣×Cpr) ÷T×1000 

= 68.36×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的乙酰乳酸定義為一個(gè)酶活力單位。

ALS（nmol /min/g 鮮重）= (ΔA+0.0096）÷0.2438×V 樣÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T×1000 

= 68.36×ΔA÷W

V 樣：加入樣本體積，0.2 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，60 min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。