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蔗糖合成酶(分解方向 SS-Ⅰ)試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-286

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義

蔗糖是源（葉片等）光合產(chǎn)物向“庫”器官運輸?shù)闹饕螒B(tài)。蔗糖合成酶（Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13）是雙向反應(yīng)酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代謝的關(guān)鍵酶之一。研究其分解方向 SS-Ⅰ 的活性對于植物蔗糖降解以及淀粉合成具有重要意義。

測定原理

SS-Ⅰ催化蔗糖和UDP生成游離果糖和UDPG ，采用3,5－二硝基水楊酸法測定還原糖的含量 來反映酶活性的高低。

需自備的儀器和用品

可見分光光度計、水浴鍋、離心機(jī)、移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰

試劑的組成和配制

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：粉劑×2 支，-20℃保存；臨用前每支加入 1.2mL 試劑二充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用；

試劑四：液體 6mL×1 瓶，4℃保存。

樣品測定的準(zhǔn)備：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計預(yù)熱 30min  以上，調(diào)節(jié)波長至 540nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定，（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

混勻，30℃準(zhǔn)確水浴 30min 后，95℃水浴 10min ，冷卻至室溫

95℃水浴 5min 左右，冷卻至室溫

混勻，540nm下測定各管吸光值。ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需要設(shè)一個對照管。

SS-Ⅰ活性計算

1 、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.0012x - 0.0492；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度 (μg/mL），y 為 ΔA。

2 、按照蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μg 還原糖定義為一個酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/mg prot)=[ (ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(V 樣×Cpr) ÷T 

= 138.9×(ΔA+0.0492) ÷Cpr

3 、按照樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μg  還原糖定義為一個酶活力單位。

SS-Ⅰ活性(μg /min/g 鮮重) =[(ΔA+0.0492) ÷0.0012×V 反總]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T 

= 138.9×(ΔA+0.0492) ÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0. 1mL； V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；V 樣總：加入提取液 體積，1 mL；T ：反應(yīng)時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。