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游離脂肪酸(FFA)測(cè)試盒(測(cè)血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞)(分光光度法) 

注意事項(xiàng)：本試劑盒用于測(cè)定血清 、動(dòng)物組織 、微生物 、細(xì)胞等樣品類型，如需測(cè)定植物組織中FFA含量請(qǐng)查詢貨號(hào) LE-1-137/LE-2-137

貨號(hào)：LE-1-061

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪酸 (FFA ) 含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo) 。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝 、糖代謝 、 內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離 脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿?nbsp;、重癥肝障礙 、 甲狀腺功能亢進(jìn)等疾病而上升。

測(cè)定原理：

用有機(jī)溶劑萃取 FFA。含有 FFA 的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅(銅皂) FFA 一 Cu。Cu 離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與 Cu 離子濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾 定律， 因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。

試劑盒的組成：

萃取液：液體 60 ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑一 ：液體 8 ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑一 ：液體 8 ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑 ×1 瓶，室溫保存。

試劑四：液體 18 ml ×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì) 、離心機(jī) 、可調(diào)式移液器 、玻璃比色皿 、蒸餾水。

樣本前處理：

1、動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（ g） ：萃取液ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 萃取液） ，進(jìn)行冰浴勻漿 。震蕩提取 15min，5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相待測(cè)。

2、血清：吸取 50 μl 血清樣本，加入 1 ml 萃取液，震蕩提取 15 min 后，4℃,   5000 rpm 離心 5 min，取有機(jī) 相待測(cè)。

3、微生物 、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)）：萃取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加 入 1 ml 萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2 秒，間隔 3 秒 ，總時(shí)間 3min）； 震蕩提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相待測(cè)。

注意：有機(jī)相待測(cè)液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層即為有機(jī)相待測(cè)液。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550 nm。

2、工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V） ：試劑二（V） ：試劑三（m）= 1（ml） 1（ml） ： 0.66（g） 的比例充分混勻 。

（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配 ，用多少配多少，在空瓶中配制 ，試劑盒中帶有 4 個(gè)空 瓶 ，先將試劑一與試劑二混合 ，最后再加入試劑三粉劑）

3、測(cè)定管：吸取750μl樣本，加入250μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃,   5000 rpm離心5 min，分層后取  600μl上層有機(jī)相，加入300μl試劑四，搖勻， 10 min后于玻璃比色皿中測(cè)定550 nm的吸光值，記為A測(cè)定。

4、空白管：吸取750μl萃取液，加入250μl工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃,   5000 rpm離心5 min，分層后   取600μl上層有機(jī)相，加入300μl試劑四，搖勻，10 min后于玻璃比色皿中測(cè)定550 nm的吸光值，記為A測(cè)定。 

空白管只需測(cè)一次 。△A=A測(cè)定-A空白

注意 ：

1、有機(jī)溶劑易揮發(fā) ，加入比色皿后應(yīng)盡快檢測(cè)。

2、測(cè)定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測(cè)液。

FFA 含量計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0322x - 0.0141      R² = 0.9985     x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml）

y：吸光值差值△A

1、血清 FFA 含量計(jì)算：

FFA 含量(μmol/ml)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V3×V1÷V2)÷ 1000 

=0.621×(△A+0.0141)

2、動(dòng)物組織 、微生物 、細(xì)胞中FFA 含量計(jì)算：

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

FFA 含量(μmol/g 鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0322×V1÷（W× V1÷V2）÷ 1000 

=0.031×(△A+0.0141)÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0322×V1÷(V1×Cpr)÷ 1000 

=0.031×(△A+0.0141)÷Cpr

V1：加入樣本體積，0.75 ml；V2：萃取液體積，1ml；V3：加入血清（漿）體積，0.05 ml；Cpr：樣本蛋 白質(zhì)濃度，mg/ml；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g；  1000： 1 μmol= 1000 nmol  。

注意事項(xiàng)：

1、蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測(cè)液直接測(cè)定，可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的 BCA 法蛋白含量測(cè)定試劑盒。

2、試劑盒最低檢出限為 20 nmol/ml。