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谷氨酸脫氫酶（GDH）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-314

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

GDH（EC 1.4.1.2）廣泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同參與谷氨酸的合成，在氨同化和轉化成有機氮化合物的代謝中起重要作用。

測定原理：

GDH 催化 NH4+ 、α-酮戊二酸和 NADH ，生成谷氨酸和 NAD+ ，引起 340nm 吸光度下降。通過測定 340nm 吸光度的下降速率，計算 GDH 活性。 

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

（1）在試劑二中加入 25mL 試劑一充分溶解混勻，置于37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物 種）水浴 5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后 12h 內用完）；

（2）取 0.05mL 樣本和0.95mL 工作液于 1mL 比色皿中，混勻，加工作液的同時開始計時，在 340 nm 波長下記錄20 秒時的初始吸光度A1 和5 分20 秒時的吸光度A2，計算 ΔA=A1-A2。

GDH 活性計算：

1、血清（漿） 中 GDH 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 

GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=643×ΔA

2、組織、細菌或細胞中GDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T

=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=643×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。

GDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣÷V 樣總×500) ÷T

=1.286×ΔA

V 反總：反應體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總 數(shù)，500 萬。