產(chǎn)品名稱：輔酶ⅡNADP(H)測試盒
產(chǎn)品規(guī)格：50管/24樣,100管/96樣
產(chǎn)品貨號：LE-1-340,LE-2-340
產(chǎn)品報價：
免費咨詢：0551-66107970
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貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
檢測方法 |
規(guī)格 |
售價（元） |
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LE-1-340 |
輔酶ⅡNADP(H)含量測試盒 |
分光光度法 |
50管/24樣 |
550 |
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LE-2-340 |
輔酶ⅡNADP(H)含量測試盒 |
微量法 |
100管/48樣 |
1000 |
貨號：LE-1-340
正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，NADP+和 NADPH 含量測定可以計算 NADP（NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反 應密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細胞氧化還原態(tài)的主要標志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和 抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。
測定原理：
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+和 NADPH 。NADPH 通過 PMS 的遞氫作用，使氧化型 噻唑藍（MTT）還原為甲瓚，570nm 下檢測吸光值，從而測定 NADPH 含量 。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還 原 NADP+為 NADPH，從而檢測 NADP+含量。
產(chǎn)品內(nèi)容：
酸性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
堿性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支 ，-20 ℃保存，用時加入 4ml 蒸餾水，混勻；用不完的試劑 4℃保存一周；
試劑三：粉劑×1 支 ，-20℃保存，用時加入 4ml 蒸餾水，混勻；用不完的試劑 4℃保存一周；
試劑四：粉劑×1 支 ，4 ℃保存，用時加入 4ml 蒸餾水，混勻；用不完的試劑 4℃保存一周；
試劑五：液體 1.8mL×1 支，4 ℃保存；
試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。
自備儀器和用品：
可見分光光度計 、 臺式離心機 、可調(diào)式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。
NADP+和 NADPH 的提取：
1、血清（漿） 中 NADP+和 NADPH 的提取
NADP+ 的提取：按照血清（漿）體積（ml） ：酸性提取液體積（ml） 為 1 ：5~ 10 的比例（建議取約 0. 1ml 血清（漿），加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上 清 ，置冰上待測。
NADPH 的提取：按照血清（漿）體積（ml）：堿性提取液體積（ml）為 1：5~ 10 的比例（建議取約 0. 1ml 血清（漿），加入 1ml 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上 清 ，置冰上待測。
2、組織中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+ 的提取：按照組織質(zhì)量（g） ：酸性提取液體積（ml） 為 1 ：5~ 10 的比例（建議取約 0. 1g 組織，加 入 1ml 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃ 離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻， 10000g 4 ℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。
NADPH 的提取：按照組織質(zhì)量（g） ：堿性提取液體積（ml） 為 1 ：5~ 10 的比例（建議取約 0. 1g 組織， 加入 1ml 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃ 離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻， 10000g 4 ℃離心 10min，取上清， 置冰上待測。
3、細胞或細菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+ 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（ 104 個） ：酸性提取液體 積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 酸性提取液） ，超聲波破碎（冰浴，功 率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次） ，95℃水浴 5min（蓋緊， 以防止水分散失） ；冰浴中 冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 堿性提取液使之中和，混勻， 10000g 4 ℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測。
NADPH 的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：堿性提取液體 積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 堿性提取液） ，超聲波破碎（冰浴，功 率 20％或 200W，超聲 3s， 間隔 10s，重復 30 次） ，95℃水浴 5min（蓋緊， 以防止水分散失） ；冰浴中 冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混勻， 10000g 4 ℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測。
測定步驟：
1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、加樣表(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：
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試劑名稱(μl) |
對照管 |
測定管 |
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樣本 |
50 |
50 |
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試劑一 |
250 |
250 |
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試劑二 |
75 |
75 |
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試劑三 |
75 |
75 |
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試劑四 |
75 |
75 |
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試劑五 |
35 |
35 |
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試劑六 |
500 |
混勻，室溫避光靜置 20min |
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試劑六 |
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500 |
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試劑七 |
1000 |
1000 |
注意事項
1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一 、二 、三和四按比例配成混合液。
2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一 、二 、三 、 四和五后必須馬上加試劑六；測定 管加完試劑一 、二 、三 、 四和五后必須反應 20min 后再加試劑六。
3、反應過程中注意避光。
4、若 NADP+測定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 測定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量 較低 ，已低于檢測限 ，可做如下調(diào)整：
（1）將測定管避光靜置時間 20min 延長到 60min；
（2）在提取階 段增加取樣量 ，即取 0.2g 樣本或 0.2ml 樣本加入 1ml 提取液。
5、由于每一個測定管需要設一個對照管，本試劑盒 50 管保證測 24 個 NADP+或 NADPH。
NADP+和 NADPH 含量的計算：
一、NADP+含量的計算
標準條件下的回歸曲線為 y = 0. 197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 為△A，x 為 NADP+濃度 nmol/ml
1、血清（漿） 中 NADP+含量計算
NADP+含量(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0. 197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)
= 101.5×(△A -0.0144）
2、組織 、細菌或細胞中 NADP+含量計算
（1）按樣本蛋白濃度計算
NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0. 197×V1) ]÷(V1×Cpr)
= 5. 1×(△A -0.0144）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
NADP+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0. 197×V1)] ÷(W×V1÷V2)
=10.2×(△A -0.0144）÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0. 197×V1)] ÷(500×V1÷V2)
=0.02×(△A -0.0144）
二、NADPH 含量的計算
標準條件下的回歸曲線為 y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 為△A，x 為 NADPH 濃度 nmol/ml
1、血清（漿） 中 NADPH 含量計算
NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)
= 16. 1× (△A -0.0259）
2、組織 、細菌或細胞中 NADPH 含量計算
（1）按樣本蛋白濃度計算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷ 1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)
= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)
=1.6× (△A -0.0259）÷W
（3）按細菌或細胞密度計算
NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)
=0.003× (△A -0.0259）
V1：加入反應體系中樣本體積，0.05ml；V2：加入提取液體積，2ml；V3：加入血清（漿）體積：0. 1ml； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。
注意 ：最低檢測限為 0.01nmol/ml 或 0.01nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot
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