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過氧化氫酶試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-159

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，是最主要的 H₂O₂ 清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測定原理：

H₂O₂ 在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能夠分解H₂O₂ ，使反應溶液 240nm 下的吸光度隨反 應時間而下降，根據吸光度的變化率可計算出CAT 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存； 

工作液：60mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 240nm 處，蒸餾水調零。

2、測定前將 CAT 檢測工作液37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min。

3 、在 1mL 石英比色皿中加入 35μL 樣本和 1mL 工作液，混勻，室溫下立即測定 240nm 下 的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算 ΔA=A1-A2

注意事項：出現負值怎么辦？

檢查反應過程是否產生氣泡，氣泡多說明酶活性太高，氣泡影響產生了負值，可以將樣 本用提取液稀釋 10 倍后再檢測。如果稀釋樣本或反應體系沒有產生氣泡仍然出現較小的負 值，說明該樣本測不到該酶活。

CAT 活性計算：

1、血清（漿）CAT 活力的計算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

 CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=678×ΔA

2、組織、細菌或細胞中 CAT 活力計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化 1nmol H₂O₂  降解定義為一個酶活力單位。 

CAT(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=678×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化 1nmol H₂O₂  降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min /g  鮮重)=[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=678×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化 1nmol H₂O₂ 降解定義為一個酶活力單位。

CAT(nmol/min /10⁴ cell) ＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1.356×ΔA

V 反總：反應體系總體積，1.035×10^-3  L；ε：H₂O₂ 摩爾消光系數，4.36×10⁴ L / mol /cm；d： 比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.035 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T： 反應時間，1 min；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；500：細胞或細菌總 數，500 萬。