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磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-149

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體55mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體8mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加3mL無水乙醇充分溶解。

試劑四：液體35mL×1 瓶，4℃避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體1mL×1 支，4℃避光保存。

產(chǎn)品說明：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰膽堿水解酶，是催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應(yīng)的一類酶的總稱，廣泛存在于高等動植物和細(xì)菌等多種生物體中，具有參與胞脂質(zhì)代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物膜形成的抗逆境脅等生理功能。

磷脂酶D催化水解磷脂酰膽堿末端的磷脂酰二酯鍵生成磷脂酸和膽堿，膽堿在膽堿氧化酶催化作用下生成甜菜堿和過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶的作用下將4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、研缽、超速冷凍離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋，無水乙醇。

操作步驟：

一、酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5-10 的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃，100000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL 試劑一。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500-1000：1 的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞，功率300w，超聲3 s，間隔7 s，總時間3min）；然后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g 離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL 試劑一。

3、血清：直接測定。

二、測定操作

三、酶活計算公式

1、按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol 膽堿所需的酶量一個酶活力單位（U）。

PLD活性（U/mg prot）= A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管×C標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr÷T= 0.017 ×（A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol 膽堿所需的酶量一個酶活力單位（U）。

PLD 活性（U/g）= A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管×C 標(biāo)準(zhǔn)÷W÷T= 0.017 ×（A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管）÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol 膽堿所需的酶量一個酶活力單位（U）。

PLD 活性（U/10⁴ cell）= A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管×C 標(biāo)準(zhǔn)÷細(xì)胞數(shù)量÷T= 0.017 ×（A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解磷脂酰膽堿產(chǎn)生1nmol 膽堿所需的酶量一個酶活力單位（U）。

PLD 活性（U/mL）= A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管×C 標(biāo)準(zhǔn)÷T= 0.017 ×（A測定管/A標(biāo)準(zhǔn)管）

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，500nmol/L； Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g/mL；T：反應(yīng)時間，30min

注意事項：

1、試劑三置于-20℃保存，臨用前配制，配置好的試劑三置于4℃保存不超過7天。

2、顯色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃離心5min 后取上清測定。

3、吸光值不宜超過1，否則用試劑一將酶液進行稀釋，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。