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海藻糖含量測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-221

正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存；

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 支，含 10mg 海藻糖。

產(chǎn)品說(shuō)明：

海藻糖存在于大量有機(jī)體中，包括細(xì)菌、藻類(lèi)、酵母、植物、昆蟲(chóng)和其他無(wú)脊椎動(dòng)物。由于海藻糖具有獨(dú)特的不同于其他碳水化合物的生物學(xué)特性，能在干旱、高溫、脫水、冷凍、高滲透壓及毒性物質(zhì)等惡劣環(huán)境下保護(hù)生物體細(xì)胞蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)、核酸等組分不受損害。

測(cè)定原理：

測(cè)定方法采用蒽酮比色法。具有靈敏度高﹑簡(jiǎn)便快捷﹑適用于微量樣品的測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)。但是蒽酮比色法也存在一定缺陷，如果樣本中含有可溶性糖，則會(huì)影響測(cè)定。本試劑盒建議用于除海藻糖外不含其他可溶性糖樣本的測(cè)定。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿﹑研缽、濃硫酸和蒸餾水。

操作步驟：

一、海藻糖提?。?/span>

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次，冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

2、組織的處理：稱(chēng)取約 0.1g 樣本，常溫研碎，加入 1mL 提取液，室溫靜置 45min，振蕩 3~5 次， 冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

3、血清（漿）的處理：吸取約 100μL 血清（漿），加入 0.9mL 提取液，室溫靜置 45min，振蕩 3~5次，冷卻后，8000g，常溫離心，取上清。

4、標(biāo)準(zhǔn)品的處理：標(biāo)準(zhǔn)品用 1mL 雙蒸水溶解，溶液濃度為 10mg/mL，稀釋到 0.1、0.08、0.06、0.04、0.02、0mg/mL。

二、測(cè)定操作表：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 620nm，蒸餾水調(diào)零。

2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。

3、工作液的配制：臨用前在每瓶試劑一中加入 16mL 蒸餾水后，緩慢加入 64mL 濃硫酸，不斷攪拌， 充分溶解，待用。用不完的試劑 4℃保存一周。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取 0.25mL 標(biāo)準(zhǔn)液和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（蓋緊，防止水分散失），自然冷卻至室溫，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 處測(cè)吸光值 A。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣本的濃度（y）和吸光度（x）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5、樣本測(cè)定：取 0.25mL 樣本和 1mL 工作液至 EP 管中，95 度水浴 10min（蓋緊，防止水分散失）， 自然冷卻至室溫，取 1mL 至比色皿中，在 620nm 處測(cè)吸光值 A。

注意：若吸光值大于 1，請(qǐng)將樣本用提取液稀釋后再測(cè)定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

三、海藻糖含量計(jì)算：

1、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中海藻糖的含量 y（mg/mL）。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

海藻糖含量(mg/g 鮮重)= V1×y÷(W×V1÷V2)=y ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

海藻糖含量(mg/mg prot)=V1×y÷(V1×Cpr)=y÷Cpr。

4、按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

海藻糖含量(μg/10⁴ cell)=（1000 × V1 × y）÷(500 × V1÷V2)=2× y

5、按血清（漿）體積含量計(jì)算

海藻糖含量（mg/mL）＝(V1×y)÷(V3×V1÷V2)=10×y

1000：1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25 mL；V2：提取液總體積，1mL； V3：加入血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。