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胞漿異檸檬酸脫氫酶（ICDHc）試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-346

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

ICDHc（EC 1.1.1.42）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化異檸檬酸脫氫脫 羧生成α-酮戊二酸，同時(shí)還原 NADP⁺ 生成 NADPH 。ICDHc 是細(xì)胞質(zhì)中除了磷酸戊糖途徑 外又一種 NADPH 重要來源，在逆境中該酶活性通常會(huì)發(fā)生顯著變化。

測(cè)定原理：

利用 ICDHc 催化 NADP⁺ 還原成 NADPH 反應(yīng)，在 340 nm下測(cè)定 NADPH 濃度的增加。

所需的儀器和用品:

紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 石英比色皿、研缽、冰 和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 50 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，4℃保存；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存； 

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二轉(zhuǎn)移至試劑一中充分溶解，置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）水浴中 預(yù)熱 10min 左右；用不完的試劑4℃保存。

3、在試劑三中加入 550μL 蒸餾水充分溶解 ，置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱 10min 左右； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、在試劑四中加入 550μL 蒸餾水充分溶解 ，置于 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃（其它物種）水浴中預(yù)熱 10min 左右； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

5、操作表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)；混勻，在 340nm 波長下記錄 20s 時(shí)的初始吸光度 A1 和 2min20s 時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)：

1、若 A2-A1 大于 0.5，需將酶液用提取液稀釋，使 A2-A1 小于 0.5 ，可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2、若 A2-A1 小于 0.005，可延長反應(yīng)時(shí)間到 5min 或 10min。 

ICDHc 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）ICDHc 活力的計(jì)算:

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

ICDHc（nmol/min/mL） ＝[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T

=2143×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中ICDHc 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=2143×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICDHc（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=2143×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

ICDHc（nmol/min /10⁴ ）=[ΔA×V 反總÷  ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=4.285×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，8×10^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總 數(shù)，500 萬。