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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：植物游離氨基酸（FAA）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）

英文名稱：Plant free amino acid ELISA KIT

【包裝規(guī)格】

96T/48T

【預(yù)期用途】

僅供科研使用，定量檢測(cè)植物標(biāo)本、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中游離氨基酸（FAA）的濃度。

【檢驗(yàn)原理】

 試劑盒采用酶聯(lián)免疫分析方法。采用生物素標(biāo)記FAA，純化的抗FAA抗體包被微孔板，在競(jìng)爭(zhēng)抑制反應(yīng)中，一定量的固相抗體與生物素標(biāo)記FAA及非標(biāo)記抗原（校準(zhǔn)品或標(biāo)本）進(jìn)行抑制競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，抗體與生物素標(biāo)記的FAA結(jié)合量受非標(biāo)記抗原量所抑制，非標(biāo)記抗原量多,抗體與生物素標(biāo)記的FAA結(jié)合就少，反之結(jié)合就多；反應(yīng)平衡后，形成固相抗體-生物素化FAA，再加入酶標(biāo)記的親和素，形成固相抗體-生物素化FAA-酶標(biāo)-親合素復(fù)合物。經(jīng)加底物顯色后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）。隨著FAA濃度的升高，OD值逐漸下降呈良好的線性關(guān)系。本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、快速等特點(diǎn)，對(duì)血清中FAA的減少或升高有可靠的檢出性能。

【主要組成成分】

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：800、400、200、100、50、0 μmol/L

本品必須按照具有潛在的感染性進(jìn)行處理，處理過程應(yīng)當(dāng)遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

1、酶標(biāo)儀

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水

4、洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、500ml量筒

7、無粉一次性乳膠手套

【儲(chǔ)存條件及有效期】

1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個(gè)月。

2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

3、開封后，按照建議的條件保存，校準(zhǔn)品、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體，有效期為14天，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

半自動(dòng)的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3，或者國(guó)產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

一. 植物標(biāo)本的精采集及保存 

1、 稱取0.1g（誤差±3%以內(nèi)）新鮮植物組織樣本，在液氮中充分研磨；

2、 加入1ml的提取液（80%甲醇）, 置于-20度過夜；

3、 于4度，8000rpm，離心1小時(shí)，取上清；

4、 上清液過C-18固相萃取柱。具體步驟是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循環(huán)。過柱后的樣本真空干燥或氮?dú)獯蹈?，保存?zhèn)溆茫?/span>

5、 上樣前加入pH7.4 PBS緩沖液（1ml定容）?；靹蚝笫覝胤胖?0分鐘，然后4度離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

二.植物標(biāo)本中相關(guān)酶或蛋白的測(cè)定：（粗提取）

1、新鮮植物組織請(qǐng)?jiān)谝旱谐浞盅心ィ?/span>

2、加入樣品體積9倍的提取液（pH 7.4 PBS緩沖液）； 請(qǐng)于4度，8000rpm，離心30分鐘，取上清并暫時(shí)保存于4度待用。

植物細(xì)胞：

用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設(shè)置破碎2s，冷卻30s的方式，充分破碎細(xì)胞，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲(chǔ)存72h，或者在- 20℃儲(chǔ)存6個(gè)月。樣本收集后，不是一次檢測(cè)完，請(qǐng)按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗(yàn)方法】

試劑準(zhǔn)備

1、使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

操作程序

1. 將各種試劑移至室溫平衡半小時(shí)，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)數(shù)量，用蒸餾水1：20稀釋，混勻后備用。

2. 將預(yù)包被板從密封袋中取出，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔，不加任何液體；每個(gè)校準(zhǔn)品設(shè)2孔，每孔加入對(duì)應(yīng)校準(zhǔn)品50μl；其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加待測(cè)血清或質(zhì)控品50μl。

3. 除空白孔外所有孔加入生物素化抗原50μl，混勻，貼上封板膜，置37℃溫育60分鐘。

4. 手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復(fù)3次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

5. 每孔加入酶標(biāo)親合素50μl（空白對(duì)照孔除外），混勻，貼上封板膜，置37℃溫育30分鐘。

6. 手工洗板：棄去孔內(nèi)液體，洗滌液注滿各孔，靜置10秒甩干，重復(fù)3次后拍干。洗板機(jī)洗板：選擇洗滌3次程序洗板后拍干。

7. 每孔加顯色劑A 50μl，顯色劑B 50μl，振蕩混勻后，置37℃避光顯色15分鐘，每孔加終止液50μl。

8. 用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng)450nm，先用空白對(duì)照孔調(diào)零點(diǎn)，然后測(cè)定各孔光密度值（OD值）。

【實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算】

檢測(cè)完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測(cè)的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度。

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測(cè)定。

6、通過其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
1.外觀和物理檢查:試劑盒應(yīng)組分齊全，內(nèi)外包裝均應(yīng)完整，標(biāo)簽清晰，液體試劑無滲漏。各組分裝量不少于表1中要求。
2.線性: 用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），在50 μmol/L – 800 μmol/L范圍內(nèi)，劑量-反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)（r）的絕對(duì)值應(yīng)不低于0.9900。
3.精密度
4.1分析內(nèi)精密度:試劑盒質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）應(yīng)不大于15.0%。
4.2批間精密度:在三個(gè)不同批次產(chǎn)品之間，質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）應(yīng)不大于15.0%
4.最低檢出限:最低檢測(cè)濃度小于1.0 μmol/L。
5.質(zhì)控品測(cè)定值: 每次檢測(cè)結(jié)果均應(yīng)在允許范圍內(nèi)。

【注意事項(xiàng)】

生物安全

1、檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對(duì)皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護(hù)手套，實(shí)驗(yàn)完成后徹底洗手。

技術(shù)提示

1、混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡。

2、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時(shí)間，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色。

6、實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

廢物處理

所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有責(zé)任根據(jù)其實(shí)驗(yàn)的類型和危險(xiǎn)性級(jí)別，進(jìn)行廢物和污物的處理，同時(shí)要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對(duì)待所有的廢物和污物。