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硝酸還原酶（NR）活性檢測試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-311

正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

誘導劑儲備液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。10 倍稀釋后使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

提取液：液體 80mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 30mL×1 瓶，-20℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入5mL提取液溶解，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。-20℃可保存 2 周。

誘導劑應(yīng)用液的配制：

用時將誘導劑儲備液用水稀釋10倍，即取10mL誘導劑儲備液加90mL蒸餾水，充分混勻。

產(chǎn)品說明：

NR（ EC 1.7. 1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，也是誘導酶，對 作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響。

NR 催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ+NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H2O，NADH 在 340nm 下 有特征吸收峰，340nm 下吸光值的變化即可表示酶活。

需自備的儀器和用品:

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、1mL 石英比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品測定的前處理

1 、取適量誘導劑于燒杯中，將新鮮標本洗凈，濾紙吸干，放入誘導劑應(yīng)用液中（淹沒即可） 避光， 浸泡2h ，取出樣本，濾紙吸干后，-20℃冷凍 30min ，取出樣本，濾紙吸干。 （根據(jù)需要進行誘導處理）

2 、稱取約 0. 1g 樣本，加入 1mL 提取液，冰浴研磨，4000g ，4℃離心 10min ，取上清置冰上待測。

二、測定步驟

1 、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm ，蒸餾水調(diào)零。

2 、樣本測定（在 EP 管中加入下列試劑）

充分混勻后測定 340nm 下的初始值 A1 ，25℃（其他物種） 或 37℃（哺乳動物） 反應(yīng) 30min 后 再次測定吸光值 A2 ，計算△A 測定管=A1 測定管-A2 測定管，△A 空白管= A1 空白管-A2 空白管，△A=△A 測定管-△A 空白管。

注意：白管只需測 1-2 次。

三、NR 活性計算：

（1）按樣本鮮重計算：

酶活單位定義：每小時每 g 鮮重樣品中消耗 1μmol NADH 的量為一個 NR 活力單位。 

NR（U/g 鮮重） =[?A×V 反總÷ （ ε×d）×106]÷(W÷V 提取×V 樣) ÷T=5.359×?A÷W。

（2）按樣本蛋白濃度計算：

酶活單位定義：每小時每 mg 組織蛋白消耗 1μmol NADH 的量為一個 NR 活力單位。 

NR（U/mg prot）=[?A×V 反總÷ （ ε×d）×106]÷(V 樣×Cpr)÷T=5.359×?A÷Cpr。

V 反總：反應(yīng)體系體積，0.001L；V 樣： 吸取樣本體積，0.06mL；V 提取： 加入提取液體積， 1mL；T：反應(yīng)時間，0.5h；ε：NADH 的摩爾消光系數(shù)： 6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑： 1cm；Cpr： 樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；106：單位換算系數(shù)，1mol=106μmol。

注意事項

1、 當測定的吸光值大于 1.5 或者?A 大于 0.6 時，建議將上清液稀釋后測定。

2、 ?A 測定過?。ㄐ∮?/span> 0.01），可延長酶促反應(yīng)時間。

3、 建議一次測定不要測定過多樣品以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時間。

4、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，空白管的初始測定值（A1 空白管）在 0.9 左右，變化不超過0.05。