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二胺氧化酶（DAO）檢測(cè)試劑盒(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-170

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

DAO(EC1.4.3.6)廣泛存在于動(dòng)物（腸粘膜 、肺 、肝臟 、 腎臟等） 、植物和微生物中 。催化多胺氧化為 醛 ，其活性與核酸和蛋白合成密切相關(guān)，能夠反映腸道機(jī)械屏障的完整性和受損傷程度。

測(cè)定原理：

DAO 催化尸胺產(chǎn)生醛和過(guò)氧化氫，外源添加過(guò)量的辣根過(guò)氧化物酶，催化過(guò)氧化氫氧化鄰聯(lián)茴香胺  生成氧化型鄰聯(lián)茴香胺，在 460nm 處有特征吸收峰，通過(guò)測(cè)定該波長(zhǎng)吸光度增加速率，計(jì)算DAO 活性。

試劑組成和配制：

提取液：液體 80ml×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 0.6ml×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 6ml×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 3ml×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

天平 、低溫離心機(jī) 、可見(jiàn)分光光度計(jì) 、 1 ml 玻璃比色皿 、蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1 、組織：按照組織質(zhì)量（g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2 、細(xì)菌 、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)  胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃,   離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3 、血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

混勻，37℃水浴 30min， 1ml 玻璃比色皿，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 A₄₆₀

酶活性計(jì)算公式：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活性定義：在 pH7.2 ，溫度為37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

DAO 活性（nmol/min/mg prot）=[ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ]×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

= 18×A460÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活性定義：在 pH7.2 ，溫度為37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 所需的酶量定義 為一個(gè)酶活力單位。

DAO 活性（nmol/min/g）= [ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T

= 18×A460÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活性定義：在 pH7.2 ，溫度為37℃條件下，每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 所需的酶量 定義為一個(gè)酶活力單位。

DAO 活性（nmol/min/10⁴cell）= [ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

= 18×A460÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

酶活性定義：在 pH7.2 ，溫度為37℃條件下，每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol H2O2 所需的酶量定 義為一個(gè)酶活力單位。

DAO 活性（nmol/min/ml）=[ A₄₆₀ ÷ (ε×d) ] ×V 反總÷V 樣÷T

= 18×A460

ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺毫摩爾消光系數(shù)：7.5 L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積， 1ml；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.25ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T： 反應(yīng)時(shí)間，30min

注意事項(xiàng)：

1、如果 OD 值小于 0.01，適當(dāng)加大提取用的樣本質(zhì)量； OD 值大于 0.8，粗酶液可適當(dāng)稀釋，或者減少提取用樣本量。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。