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貨號：LE-1-338

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

磷酸戊糖途徑途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）和6PGDH依次催化NADPH合成，與能量的平衡、生長速率和細(xì)胞活力等密切相關(guān)。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。

測定原理：

6PGDH 催化6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH在340nm有特征吸收峰，而NADP+沒有；通過測定340nm 吸光度增加速率，計(jì)算 6PGDH 活性。

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 石英比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前配制，加入 5 mL 試劑一，混勻。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前配制，加入 5 mL 試劑一，混勻。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10 ⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清、培養(yǎng)液等液體：直接測定。

測定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑一置于25℃或者 37℃水浴預(yù)熱30min。

3. 空白管：取1mL石英比色皿，依次加入100μL 蒸餾水，100μL 試劑二，700μL試劑一，100μL 試劑三，于 340nm 處測定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為 A1，第 190s 吸光值記為 A2。△A 空白管=A2-A1

4. 測定管：取 1mL石英比色皿，依次加入100μL 粗酶液，100μL試劑二，700μL試劑一，100μL 試劑三，于 340nm 處測定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 吸光值記為 A3，第 190s 吸光值記為 A4。△A 測定管=A4-A3

注意：空白管只需要做一次。

計(jì)算公式：

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 的酶量為1個(gè)酶活單位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/mg prot)= [(△A測定管-△A空白管)×V 反總÷ε÷d×10⁹]÷(Cpr×V樣)÷T= 535.9×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/g) = [(△A 測定管-△A 空白管)×V 反總÷ε÷d×10⁹]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T= 535.9×(△A測定管-△A空白管)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：每 10 4 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/10⁴ cell) = [(△A 測定管-△A 空白管)×V 反總÷ε÷d×10⁹ ]÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T= 535.9×(△A 測定管-△A 空白管)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

6PGDH 酶活性(nmol/min/mL) = [(△A 測定管-△A 空白管)×V 反總÷ε÷d×10⁹]÷V 樣÷T= 535.9×(△A 測定管-△A 空白管)

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.001 L；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司 BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；V 樣：反應(yīng)體系中加入粗酶液體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，3 min。

注意事項(xiàng)：

1、樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在提取當(dāng)日完成酶活性測定，粗酶液避免反復(fù)凍融；

2、試劑二和試劑三須現(xiàn)配現(xiàn)用，當(dāng)天未用完試劑保存在 4℃，可保存 2 天。