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乙醇脫氫酶活性測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-140

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

ADH 是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過程中起著 重要作用。哺乳動(dòng)物 ADH 主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致 ADH 釋放到血清中。血清 ADH 活性高低反映了肝功能是否異常。

測定原理：

ADH 催化 NADH 還原乙醛生成乙醇和 NAD+，NADH 在 340nm 處有吸收峰，而 NAD+沒有； 測定 340nm  吸光度下降速率，來計(jì)算 ADH 活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，室溫保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×2 瓶，－20℃保存。臨用前加入 22mL 試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。(注意：試劑三為 微量粉劑可能肉眼看不見，正常溶解即可）

試劑四：液體×1 支，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g ，4℃離心 20min ，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）； 16000g ， 4℃離心 20min ，取上清液置冰上待測。

3、血清等液體：直接測定。

ADH 測定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min ，調(diào)節(jié)波長到 340 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑三在 25℃水浴中保溫 30 min。

3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 100μL 樣本上清液、800μL 試劑三和 100μL 試劑四，迅速 混勻后于 340nm 測定吸光值變化，分別記錄 15s 和 75s 時(shí)吸光值，分別記為 A1 和 A2。 △A 測定管=A1-A2。

計(jì)算公式：

1、按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(Cpr×V 樣)÷T 

= 1608×△÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

= 1608×△A÷W

3、按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位

ADH (nmol/min/10⁴ cell) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

4、按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1nmol NADH  為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mL) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷V 樣÷T 

= 1608×△A

ε ：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d： 比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總 體積，1000μL=0.001 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V 樣：加入 反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0. 1 mL；T ：反應(yīng)時(shí)間，1min。