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游離膽固醇含量測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-147

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

FC 是構成細胞膜的主要成分，也是合成腎上腺皮質激素、性激素、膽汁酸及維生素 D等生理活性物 質的重要原料 。FC 濃度可作為脂代謝的指標。

測定原理：

FC 氧化酶催化 FC 生成△4-膽甾烯酮和 H2O2 ，過氧化物酶催化 H2O2 、4-氨基安替比林和酚生成紅色醌 類化合物，在 500nm 有吸收峰，其顏色深淺與 FC 含量成正比。

試劑盒的組成：

試劑一：異丙醇（自備）50 ml ×1 瓶

試劑二：液體 50ml ×1 瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑 × 1 瓶，4℃保存。

試劑四：液體 100μl ×1 瓶，4℃保存。

TC標準品：液體 1ml×1 支 ，0.5μmol/ml，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見分光光度計 、水浴鍋 、可調式移液槍 、 1ml 玻璃比色皿 、異丙醇和蒸餾水。

FC 的提取：

1 、組織：按照組織質量（ g） ：試劑一體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 試劑 一）進行冰浴勻漿 。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2、細菌、真菌：先收集400-500 萬細胞或細菌到離心管內，棄上清，加 1ml 試劑一，超聲波破碎 1min（強 度 20％ ，超聲 2s，停 1s） ，即 FC 待測液。

3、血清（漿）樣品：直接測定。

測定操作：

1、分光光度計預熱 30 min，調節(jié)波長到 500 nm，蒸餾水調零。

2、FC 工作液的配制：臨用前，吸取約 0.8ml 試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中，充分溶解后再全部轉移回試劑二瓶中，充分混勻，FC 工作液置于 37℃水浴 10min 。用不完的工作液 4℃保存一周。

3、標準管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl FC 標準液和 900μl FC 工作液，混勻，37℃靜置 3h 后于 500nm 測定 A 標準管。

4、測定管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl FC 待測液和 900μl FC 工作液，混勻，37℃靜置 3h 后于 500nm 測定 A 測定管。

5、空白管：依次在 1ml 玻璃比色皿中加入 100μl  試劑一和 900μl FC 工作液，混勻，37℃靜置 3h 后于 500nm 測定 A 測定管。

注意事項：

1、標準管和空白管只需測定一次。

2、若測定管產(chǎn)生白色渾濁，可以將待測液用異丙醇稀釋 2~5 倍后測定，并在最后結果乘以相應倍數(shù)。

FC計算公式：

1、血清（漿） 中 FC 含量計算：

FC 含量( μmol /dL）= C 標準液×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）×100ml 

=50×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）

C 標準液：0.5μmol/ml； 100 ml： 1dL= 100 ml。

2、組織中FC 含量計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

FC 含量( μmol / mg prot）= C 標準液×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷Cpr 

= 0.5×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

FC 含量  ( μmol / g 鮮重）= C 標準液×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷W 

= 0.5×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷W

C 標準液：0.5μmol/ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質量，g/ml

3、細胞、細菌中FC 含量計算：

FC 含量  ( μmol /10⁴ cell）= C 標準液×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷細菌或細胞（10⁴  cell /L）

=0.5×（A 測定管-A 空白管）÷（A 標準管-A 空白管）÷細菌或細胞（ 10⁴ cell /L）

C 標準液：0.5μmol/ml。

試劑盒最低檢出限為 1nmol/ml。