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貨號：LE-1-364

正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AKP/ALP 是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化 合物。AKP/ALP 廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。

測定原理：

在堿性環(huán)境中，AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與4-氨基安替比林和鐵氰化鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在 510nm 有特征光吸收；通過測定 510 nm 吸光度增加速率，來計算 AKP 活性。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體×1瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體×1瓶，4℃避光保存，未變成藍綠色之前均可使用。

標準品：液體×1 支（EP 管中），2 μ mol/mL 酚標準液 ，4℃保存。

粗酶液提取：

1、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿 ，4℃ 、8000g 離心 10min，取上清液待測。

2、細菌或細胞：按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一）， 冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒， 間隔 7 秒，總時間3min）；然后 8000g，4℃,離心 10min，取上清置于冰上待測。

3、血液可直接測定，或者適當稀釋后測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 510 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3、空白管：取 EP 管，加入 20μL 蒸餾水 ，200μL 試劑二 ，200μL 試劑三，混勻后置于37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μL，混勻后于 510 nm測定吸光度，記為 A 空白管。

4、標準管： 取 EP 管，加入 20μL 標準品 ，200μL 試劑二，200μL 試劑三，混勻后置于37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μL，混勻后于 510 nm測定吸光度，記為 A 標準管。

5、對照管： 取 EP 管，加入 20μL 上清液 ，200μL 蒸餾水 ，200μL 試劑三，混勻后置于 37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μL，混勻后于 510 nm測定吸光度，記為 A 測定管。

6、測定管：取 EP 管，加入 20μL 上清液 ，200μL 試劑二，200μL 試劑三，混勻后置于37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μL，混勻后于 510 nm測定吸光度，記為 A 測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次，每個測定管設(shè)一個對照管。

AKP/ALP 活性計算：

1、血液中 AKP/ALP 活力計算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP 活力(μmol/min /mL)= [C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×V 反 總] ÷V 樣÷T

=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)

2、組織、細菌或細胞中AKP/ALP 活性計算

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/mg  prot)=[C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×V 反 總]÷(Cpr×V 樣)÷T

=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP(μmol/min/g  鮮重)=[C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A  空白管)×V 反 總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷W

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP (μmol/min/10⁴ cell)=  [C 標準品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)×V 反  總]÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

= 6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管) ÷細胞數(shù)量

C 標準品：2μmol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL）， 1020μL=1.02 mL；  V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），0.020mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間（min）， 15 min。

注意事項：

1、試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。

2、試劑四變藍綠色后不能再使用。

3、加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不完全。