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糖原合成酶（GCS）試劑盒說(shuō)明書（分光光度法）
貨號(hào)：LE-1-352

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

GCS（EC 2.4.1.11）催化 UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和 UTP， 以α-1 ，4-糖苷鍵相連延長(zhǎng)糖鏈，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰島素作用的主要靶酶，對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)和血糖 穩(wěn)態(tài)的維持具有重要作用。

測(cè)定原理：

GCS 催化 UDPG 和葡萄糖殘基生成糖原和 UDP，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD⁺ ，在 340nm 下測(cè)定 NADH 下降速率，即可反映 GCS 活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、 1 mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 45 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 5mL×1 瓶 ，4℃保存；

試劑三：液體 41μL×1 支，4℃保存；

試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；

試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑三和試劑四轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑五的配制：臨用前在試劑五瓶中加入 2.5mL 試劑二充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、將工作液和試劑五置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘。

5、 在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 樣本、50μL 試劑五和 900μL 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

注意：

在該試劑盒中，若 ΔA 大于 0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測(cè)定，使 ΔA 小 于 0.1 可提高檢測(cè)靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

GCS 活性計(jì)算：

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/mg prot） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=3215×ΔA÷Cpr

2、按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GCS（nmol/min/g 鮮重） ＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=3215×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積， 1×10^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積， 1 mL； T： 反應(yīng)時(shí)間， 1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。