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葡萄糖-6-磷酸(6PG)含量測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-234

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

6PG (Glucose-6-phosphate，葡萄糖-6-磷酸，又稱 6-磷酸葡萄糖)，是糖酵解和磷酸戊糖途徑的中間產(chǎn)物，廣泛存在于動植物體和微生物中。在糖酵解的第一步反應(yīng)中，葡萄糖被己糖激酶催化生成葡萄糖-6-磷酸，然后通過磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的催化形成果糖-6-磷酸，以繼續(xù)糖 酵解的其它步驟；而在戊糖磷酸途徑中，葡萄糖-6-磷酸是其第一個底物，該過程也是生成 NADPH 的主要途徑。此外，葡萄糖-6-磷酸也能轉(zhuǎn)化形成糖原或淀粉而被儲存起來。

測定原理：

6-磷酸葡萄糖脫氫酶可催化 6PG 和 NADP+生成 6 磷酸葡萄糖酸和 NADPH ，NADPH  在 1-mPMS 的作用下使  WST-8 顯橙黃色，在 450 nm 下測定吸光值。

需自備的儀器和用品：

分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 60 mL×1 瓶，4℃保存； 

試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體 3mL×1 瓶， 4℃避光保存。

6PG 提?。?/span>

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）， 8000g ， 25℃離心 10min，取上清待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿，8000g ，25℃離心 10min ，取上清待測。

3、血清（漿）等液體樣品：直接測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二的配制：臨用前加入 8mL 水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存；

3、工作液的配制：臨用前按照樣本數(shù)量，按以下比例配制工作液

4、樣本測定

按下表在比色皿中加入如下試劑

37℃避光孵育 30min，450nm 下測定吸光值 A 測定與 A 對照，△A=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

6PG 含量計算：

1、標準條件下測定回歸方程為 y = 7.7178x - 0.0016，R² = 0.997；x 為 6PG 含量( μmol/mL）， y 為吸光值。

2、按照血清（漿）體積計算

6PG 含量（nmol/mL）= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷×V1×1000 

=129.6×(△A+0.0016)

3、按照蛋白濃度計算

6PG 含量（nmol/mg prot）= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷(V1×Cpr)×1000 

=129.6×(△A+0.0016) ÷Cpr

4、按照樣品質(zhì)量計算

6PG 含量（nmol/g 鮮重）= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷(W ×V1÷V2）×1000 

=129.6×(△A+0.0016) ÷W

5、按照細菌或細胞密度計算

6PG 含量（nmol/10⁴ cell）= [(△A+0.0016)÷7.7178×V1]÷（500×V1÷V2）×1000 

=0.259×(△A+0.0016)

V1 ：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V2：加入提取液體積，1 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì) 濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500 ：細菌或細胞總數(shù)，500  萬；1000 ， μmol  到 nmol 的換算系數(shù)。