伊人久久大香线焦|久久青青草国产第一页|亚洲国产九九九热视频|超乳视频爆乳无码免费专区|欧美日韩亚洲视频一区二区|少妇高潮惨叫喷水在线观看|亚洲区欧美区偷拍区中文字幕|国产日韩一区二区三区在线观看

脫氫酶(DHA) 試劑盒說(shuō)明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-379

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

脫氫酶(dehydrogenase, DHA) 是一類催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶，催化底物通過(guò)細(xì)胞色素系統(tǒng)被氧化，釋放的能量供機(jī)體使用，是生物體取得能量的一種方式。

測(cè)定原理：

在細(xì)胞呼吸過(guò)程中，氫受體 2, 3, 5 - 氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC）在脫氫酶作用下接受氫以后，被還原為三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone, TF），TF 呈現(xiàn)紅色，在波長(zhǎng) 485nm 處有最大吸收峰，采用分光光度法于 485nm 測(cè)定其吸光值，即得脫氫酶活性。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50ml×1瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，使用前加 10ml 試劑二溶解，4℃避光保存（盡量現(xiàn)配現(xiàn)用）。

試劑二：液體20ml×1瓶，4℃保存。

試劑三：甲醇（自備）。

需自備儀器和用品：

篩子、天平、恒溫培養(yǎng)箱或水浴鍋、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、冰 、蒸餾水 、甲醇（不允許快遞，請(qǐng)用戶自備）。

樣品處理：

1 、細(xì)菌 、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)  胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃,  離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2 、組織 ：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 8000g，4℃,   離心 20min。

3 、液體 ：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

充分混勻，37℃培養(yǎng) 24h

振蕩 1h，8000g，25℃,   離心 5min，取 1ml 上清于比色皿，測(cè)定 A485，△A=A 測(cè)定-A 空白管 。空白 管只要做一管。

脫氫酶活力計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0422x - 0.0312；R² = 0.9988；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度   ( μg/ml） ，y 為吸光值。

1、按照蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每 mg 蛋白樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA ( μg/ min / mg prot）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（ Cpr×V 樣）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每克樣品每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA ( μg/ min /g  鮮重）=(△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 0.181× (△A+0.0312） ÷W

3、按液體體積計(jì)算

酶活單位定義：在 37℃時(shí)，每 ml 樣本每min 催化產(chǎn)生 1μgTF 為一個(gè)酶活性單位。

DHA ( μg/ min /ml）= (△A+0.0312）÷ 0.0422×V 反總÷V 樣÷T

= 0.181× (△A+0.0312）

V 反總：反應(yīng)總體積，1.65ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0. 15ml；T：培養(yǎng)時(shí)間，1d= 1440min； W：樣品質(zhì)量，g； Cpr：蛋白濃度，mg/ml。

注意事項(xiàng)：

配制好的試劑一避光保存于 4℃, 最好在一周內(nèi)使用，若出現(xiàn)紅色，則不能使用。