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亞硝酸還原酶試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-312

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3 ，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

測(cè)定原理

亞硝酸還原酶可將 NO₂—還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO₂— 減少，即 540nm 處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、研缽、可見分光光度計(jì)、水浴鍋、低溫離心機(jī)、1mL 玻璃比色皿。

試劑的組成和配制

提取液：液體 80mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 12mL 蒸餾水溶解。

試劑三：液體 12mL×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。

酶液提取

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議

500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w ，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時(shí)間 3min）；然后 10000g ，4℃離心 10min ，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表

計(jì)算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x + 0.0072 ，R² = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度 (μmol/mL），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）。

1、按照蛋白含量計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時(shí)還原 1μmol NO₂— 的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR (μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每小時(shí)還原 1μmol NO₂— 的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR (μmol/h/g  鮮重）=[A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)還原 1μmol NO₂— 的量為一個(gè)酶活力單位。

NiR (μmol/h /10⁴ cell）= [A 空白管-(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)-0.0072]÷ 1.3594×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量 ×V 樣÷V 樣總）÷T

= 1.47×（A 空白管-A 測(cè)定管+A 對(duì)照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量

V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.2mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0. 1mL；V 樣總：加入提取液體 積，1mL；T ：反應(yīng)時(shí)間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)

1、配制好的工作液 3 天內(nèi)使用完。

2、若吸光值超過 3 ，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以 稀釋倍數(shù)。

3、嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會(huì)對(duì)結(jié)果有影響。

4、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

4、A 空白管-（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）線性范圍為 0.02-3。