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乙酰膽堿酯酶（AchE）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-362

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

AchE 屬于絲氨酸水解酶，廣泛存在于各種動(dòng)物組織和血清中。AchE 催化乙酰膽堿（Ach）水解，在神經(jīng)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)中起重要作用。

測(cè)定原理：

AchE 催化 Ach 水解生成膽堿，膽堿與二硫對(duì)硝基苯甲酸（DTNB）作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）； TNB 在 412nm 處有吸收峰，通過(guò)測(cè)定 412  nm 吸光度增加速率，計(jì)算 AchE 活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6mL 試劑一，充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入 2.6mL 試劑一，充分震蕩溶解。

粗酶液提?。?/span>

1、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿 ，8000g 4℃離心 10min，取上清液待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 試劑一體積（mL）為  500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑二置于 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

3、取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 上清液、800 μL 試劑一、50μL 試劑二和 50  μL 試劑三，迅速混勻，于 412nm 處測(cè)定 3min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 吸光值記為 A1，第 190s 吸 光值記為 A2 。△A 測(cè)定管=A2-A1。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

AchE 活性計(jì)算公式：

1、組織 AchE 活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（Cpr ×V 樣）÷T 

= 245×△A÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鮮重)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T 

= 245×△A÷W

2、細(xì)菌、細(xì)胞 AchE 活性

活性單位定義：每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 245×△A÷細(xì)胞數(shù)量

3、血清 AchE 活性

活性單位定義：每毫升血清每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 的酶量為 1 個(gè)酶活單位。

AchE 酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷V 樣÷T

=245×△A

ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，13.6×10³ L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L）， 1 mL=0.001 L； 10⁶： 1mol=1×10⁶μmol；V  樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL）；W：  樣本質(zhì)量，g；V 樣：加入上清液體積（mL）， 0.1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），3 min。