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檸檬酸（CA）含量測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-212

正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 0.1mL×1 支，-20℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，室溫保存。臨用前配制，加入 5mL 試劑一，充分溶解。

試劑五：液體 5mL×1 瓶，4℃避光保存。

標準品：液體 1mL×1 支，1mmol/L 檸檬酸標準液，4℃保存； 臨用前用水稀釋成 250μmol/L 檸 檬酸標準液。

產(chǎn)品說明：

CA 是生物體內(nèi)常見的有機酸，是重要的食品風味物質(zhì)。此外，CA是三羧酸循環(huán)第一步反應的產(chǎn)物。

測定原理：

酸性條件下，檸檬酸還原 Cr⁶⁺ 生成 Cr³⁺，在 545nm 處有特征吸收峰； 通過測定 545nm 吸光值的 增加，即可計算出樣品中檸檬酸含量。

自備儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣品中檸檬酸提?。?/span>

1、液體樣品中檸檬酸提?。?/span>取 0. 1mL 液體加試劑一 0.9mL，充分混勻，11000g/min 4℃離心 10min， 取上清液，待測。

2、組織中檸檬酸提?。?/span>稱約 0. 1g 組織， 加入 1mL 試劑一， 冰上充分研磨， 11000g/min 4℃離心 10min， 取上清液，待測。

3、線粒體中檸檬酸提?。?/span>稱約 0. 1g 組織，加入 1mL 試劑一，冰上充分研磨，600g/min ，4℃離心 5min ；取上清至另一 EP 管中，11000g/min ，4℃離心 10min ，棄上清（此上清液可用于細胞質(zhì) CA 含量測定）； 向沉淀中加試劑二 200μL ，以及試劑三 2μL ，充分懸浮溶解，11000g/min ，4℃ 離心 10min ，取上清液，待測。

二、測定步驟：

1、分光光度計預熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 545 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置于 30℃水浴中預熱 30min 以上。

3、按下表在 1.5mLEP 管中加入相應試劑

三、檸檬酸含量計算：

1、按液體樣品的體積計算：

檸檬酸含量（mmol/L）=[C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×F 

=2.5×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

C 標準液：標準品的濃度，250μmol/L=0.25 mmol/L；F：樣本稀釋倍數(shù)， （0. 1 mL 樣品+0.9mL

試劑一） ÷0. 1 mL 樣品=10。

2、按組織鮮重計算：

檸檬酸含量（ μ mol/g  鮮重） =[C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)]×V 總÷W 

= 0.25×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管) ÷W

C 標準液：標準品的濃度，250 μ mol/L；V 總： 上清液總體積，1.0mL=0.001L；W：樣品質(zhì)量，g。

3、按線粒體蛋白含量計算：

檸檬酸含量（ μmol/mg prot）=[C 標準液×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)] ×V 樣÷ （Cpr×V 樣）

=0.25×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)÷Cpr

C 標準液：標準品的濃度，250 μmol/L=0.25μmol/mL；V 樣： 加入的樣本體積，100μL=0. 1mL； Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL。

注意事項：

1、樣品處理等過程均需要在冰上進行。

2、試劑五為易致癌物質(zhì)，實驗過程中，需佩戴手套，避免試劑五濺到皮膚上。

3、檸檬酸提取液不能用于蛋白含量測定，如需測定蛋白含量，需另取組織，使用本公司 BCA 試劑盒進行測定。

4、若反應 30min 后有明顯的黑色小顆粒，屬于正?，F(xiàn)象，需將樣本稀釋后再測。