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貨號：LE-1-203

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

谷氨酸脫羧酶是將谷氨酸轉(zhuǎn)化成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）的限速酶，γ-氨基丁酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、增進(jìn)腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、保持神經(jīng)安定、促進(jìn)生長激素分泌和保肝利腎等作用，目前在醫(yī)藥和保健食品中已有廣泛的應(yīng)用。

測定原理：

GAD 催化谷氨酸產(chǎn)生 GABA，利用 berthelot 反應(yīng)測定 GABA 含量，從而測定 GAD 活性。

需自備的儀器和用品：

分光光度計、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 30mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 6mL×1  瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：液體 10mL×1  瓶，4℃保存；

試劑五：液體 20mL×1 瓶，4℃避光保存；

試劑六：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑七：液體 35mL×1  瓶，4℃保存。

樣品測定的準(zhǔn)備：

1、細(xì)菌或細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3S，間隔 10S，重復(fù)30 次）；8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織的處理：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），冰浴中勻漿。8000g ，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、在EP 管中加入如下試劑

混勻，40℃水浴反應(yīng) 1h，95℃水浴 10 分鐘終止反應(yīng)，冷卻至室溫，取反應(yīng)液待用。

2、在新 EP 管中加入如下試劑

混勻，室溫靜置 5min。

混勻，室溫靜置 5min。

混勻，取 1mL 于 1mL 玻璃比色皿，測定 640nm 下吸光值 A 測定與A 對照，ΔA=A 測定-A 對照，每個測定管設(shè)一個對照管。

GAD 活力計算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為 y = 0.1364x - 0.0432，R² = 0.999；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y 為吸光值。

2、按照蛋白濃度計算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol GABA 定義為一個酶活力單位。

GAD 活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T

=0.366×(ΔA+0.0432) ÷Cpr

3、按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol GABA 定義為一個酶活力單位。

GAD 活力(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.366×(ΔA+0.0432) ÷W

4、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol GABA 定義為一個酶活力單位。

GAD 活力(μmol/min/10⁴ cell)=(ΔA+0.0432) ÷0.1364×V 反總÷(500 ×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.0007×(ΔA+0.0432)

V 樣：加入樣本體積：0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積， 0.3mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬； T：反應(yīng)時間，60min。