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谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活性測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-192

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

GPT（EC 2.6. 1.2）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化氨基酸和酮酸轉(zhuǎn)氨 基反應，在氨基酸代謝中具有重要作用。此外，哺乳動物肝細胞 GPT 活性很高，當肝細胞 壞死，GPT 釋放到血液中，血清 GPT 活性顯著增高。因此，GPT 被世界衛(wèi)生組織推薦為肝 功能損害最敏感的檢測指標。

測定原理

GPT 催化丙氨酸和α-酮戊二酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應，生成丙酮酸和谷氨酸；加入 2,4-二硝基苯肼 溶液，不僅終止上述反應，而且與酮酸中的羰基加成，生成丙酮酸苯腙；苯腙在堿性條件下 呈紅棕色，可以在 505nm 讀取吸光值并計算酶活力。

試驗中所需的儀器和用品

可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑的組成和配制

提取液：30mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：液體 6 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：液體 60 mL×1 瓶，4℃保存；

樣品測定的準備

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織， 加入 1mL 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定操作表：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 505nm ，蒸餾水調(diào)零。

2、 在 EP 管中加入下列試劑

混勻后，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確反應 20min

混勻后，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）準確水浴 20min

混勻，室溫放置 10min ，在 505nm 波長處，測各管吸光度 A 。 ΔA=A 測定管-A 對照管。 每個測定管需設(shè)一個對照管。

注意：

血清(漿)等樣本煮沸過程中可能出現(xiàn)果凍狀沉淀，可取消煮沸步驟，直接加入未煮沸 的 10μL 樣本。

計算方式

1、標準條件下測定的回歸曲線，y = 0.4228x+0.0003 (x為標準品濃度，umol/mL；y 為 ΔA)。

2、血清（漿）GPT 活力的計算

單位的定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GPT（nmol/min/mL）=  (ΔA-0.0003）÷0.4228÷T×103= 118.26×  (ΔA-0.0003）

3、細胞、細菌和組織中GPT 活力的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GPT（nmol/min/mg prot）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ 

= 118.26×(ΔA-0.0003） ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。

GPT（nmol/min/g 鮮重）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ 

= 118.26× (ΔA-0.0003）÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 丙酮酸定義為一個酶活力單位。 GPT（nmol/min/10⁴ cell）=[(ΔA-0.0003）÷0.4228×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ 

=0.236×(ΔA-0.0003）

V1：加入反應體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，20min； Cpr：蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬；103：1umol/mL= 103   nmol/mL。

1、標準曲線線性范圍為：0.01 umol/mL -2 umol/mL。

2、ΔA 線性范圍為：0.01 -2。