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貨號(hào)：LE-1-230

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義

HK（EC 2.7.1.1 ）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是葡萄糖分解過程中的第 一個(gè)關(guān)鍵酶，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途徑的交 叉點(diǎn)。

測(cè)定原理

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步催化 6-磷酸葡萄糖脫氫生成 NADPH ，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。

需自備的儀器和用品

紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 30mL×1 瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入 30mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：液體 5 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入 4mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入 2mL 蒸餾水充分溶解備用；用不完的試劑分裝 后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入 250μL 試劑一和 250μL 蒸餾水充分溶解備用； 用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

樣本的前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量 （10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提 取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑一、二、三、 四和五 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。

3、加樣表：

將上述試劑按順序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在 340 nm 波長下記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度 A1 和 5 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、為了減小操作誤差，建議將試劑一、二、三、四、五按比例配成混合液，預(yù)熱 10min， 取 30μL樣本 + 8μL 試劑六 + 1mL 混合液，混勻后按照上述步驟檢測(cè)。

2、不同勻漿組織中 HK 活力不一樣，做正式試驗(yàn)之前請(qǐng)做 1-2 只預(yù)實(shí)驗(yàn)，若 ΔA>0.5 ，則說明組織活力太高，必須用提取液稀釋成適當(dāng)濃度勻漿上清液（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）， 或縮短反應(yīng)時(shí)間至 2min,使 ΔA<0.5，以提高檢測(cè)靈敏度。

HK 活性計(jì)算

1、血清（漿）HK 活性

單位的定義：每毫升血清（漿）在每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1113×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 HK 活性

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。 

HK（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1113×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

HK（nmol/min /g  鮮重）＝[ΔA×V 反總÷ (ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1113×ΔA÷W