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過氧化氫含量試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-164

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

H2O2 是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，主要由 SOD 和 XOD 等催化產(chǎn)生， 由 CAT 和 POD 等催化降 解 。H2O2 不僅是重要的活性氧之一 ，也是活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐 。一方面，H2O2 可以直接或間接地氧化 細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面 H2O2  也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

測(cè)定原理：

H2O2 與硫酸鈦生成黃色的過氧化鈦復(fù)合物，在 415nm 有特征吸收。

試劑的組成和配制：

試劑一： 丙酮 60mL×1 瓶，4℃保存；（自備）

試劑二：粉劑×1瓶 ，4℃保存；臨用前加入 10ml 濃鹽酸充分溶解備用 。用不完的試劑 4℃保存；(溶 解時(shí)間較長(zhǎng)，約 30min，可 40℃-60℃加熱溶解，務(wù)必提前準(zhǔn)備)

試劑三： 液體 15mL×1 瓶，4℃保存； 

試劑四： 液體 60mL×1 瓶，4℃保存； 

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì) 、 臺(tái)式離心機(jī) 、可調(diào)式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、丙酮 60ml 、濃鹽酸 10ml 、研缽和 冰。

H2O2 提?。?/span>

1、細(xì)菌或細(xì)胞樣品的制備：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（ 10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一） ，超聲波破碎 細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；用試劑一定容至 1ml；8000g 4℃ 離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織樣品的制備：按照組織質(zhì)量（ g） ：試劑一體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組 織 ，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿；轉(zhuǎn)移至 EP 管中，用試劑一定容至 1ml，8000g 4℃離心 10min，取 上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 415nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑二 、三和四 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 10min 以上。

3、在 EP 管中按順序加入下列試劑

4000g，25℃離心 10min，棄上清，留沉淀

加入試劑四溶解沉淀后，室溫靜置 5min，倒入比色皿中，測(cè)定 415nm 處吸光值 A 。對(duì)照管只要做一 次即可 。計(jì)算ΔA＝A 測(cè)定-A 對(duì)照。

注意事項(xiàng):

1、由于試劑一易揮發(fā)，試劑一必須先預(yù)冷再加，研磨時(shí)必須在冰上研磨。

2、本試劑盒中試劑的揮發(fā)性較高，請(qǐng)帶一次性手套和口罩。

H2O2 含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸曲線，y = 0.7488x + 0.0006 (x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，μmol/ml；y 為ΔA)。

2、血清（漿） 中 H2O2 含量的計(jì)算：

H2O2 含量  ( μmol/ml）＝(ΔA-0.0006) ÷0.7488

= 1.34×(ΔA-0.0006)

3 、細(xì)菌 、細(xì)胞或組織中 H2O2 含量計(jì)算

（ 1）按照蛋白濃度計(jì)算

H2O2 含量(μmol/mg prot)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(V1×Cpr)

= 1.34×(ΔA-0.0006)÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

H2O2 含量(μmol/g 鮮重)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(W ×V1÷V2)

= 1.34×(ΔA-0.0006)÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

H2O2 含量(μmol/10⁴)= [ (ΔA-0.0006) ÷0.7488×V1]÷(500×V1÷V2)

=0.0027×(ΔA-0.0006)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積， 1ml；V2：加入提取液體積， 1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

注意：

標(biāo)曲線性范圍為 0. 1μmol/ml 到 2μmol/ml，吸光度ΔA 線性范圍為 0.07-1.5 ，若ΔA 超過 1.5 則需 要稀釋，計(jì)算公式乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。