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β-淀粉酶( β-AL）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-085

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

淀粉酶負(fù)責(zé)水解淀粉，主要包括 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可隨機(jī)地作用于 淀粉中的 α-1,4-糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。

測(cè)定原理：

還原糖還原 3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐熱。根據(jù)上 述特性，鈍化其中之一 ，就可測(cè)出另一種淀粉酶的活力。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：50mL×1 瓶，常溫保存，若有黃色晶體析出，需 90℃加熱溶解后再用；

試劑二：40mL×1 瓶，4℃保存，若有沉淀析出，需 70℃加熱后再用。

粗酶液提取：

組織： 稱取 0.1~0.2g 樣本（建議稱取約 0.1g 樣本），加入 1mL 蒸餾水，研磨勻漿；將勻漿  倒入離心管中，提取液在室溫下放置提取 15min，每 5min 振蕩 1 次，使其充分提?。?/span>3000g， 25℃離心 10min，取上清液加蒸餾水定容至 10 mL ，搖勻，即淀粉酶原液。

吸取上述淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 蒸餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于(α+β)淀 粉酶總活力的測(cè)定。

血清（漿）等液體樣本：（1）直接檢測(cè) α-淀粉酶 。（2）吸取淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 蒸 餾水，搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于(α+β)淀粉酶總活力的測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 540 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二 40℃預(yù)熱 10min。

3、測(cè)定操作表：

70℃水浴 15min 左右 ，冷卻

在 40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫 5min

混勻，95℃水浴 5min，冷卻，在 540nm 下測(cè)定吸光度，從左到右分別記為 A1 、A2、A3 和 A4。

酶活性計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定回歸曲線為 y=3.7215x -0.1778； x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值。

2、α-淀粉酶活性

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活力單位。

α-淀粉酶活性(mg/min/g 鮮重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

= 1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活性單位。

α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V 反總]÷（V 樣×Cpr）÷T 

=0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中α-淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活性單位。

α-淀粉酶活性(mg/min/mL)=  [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V  反總]÷V 樣÷T

=0.1075×(A2-A1+ 0.1778)

3、總淀粉酶活性計(jì)算

（1）按照樣品質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每 g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活力單位。

總淀粉酶活性 (mg/min/g 鮮 重 )=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反總]÷(W×V 樣 ÷V 樣總)÷T

=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活力單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反總]÷（V 樣×Cpr）÷T 

=0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr

（3）血清（漿）等液體樣本中總淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活性單位。

總淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反總]÷V 樣÷T 

=0.5375×(A4-A3＋0.1778)

4、β-淀粉酶活性計(jì)算

（1）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位定義：每 g 組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活力單位。

β-淀粉酶活性 (mg/min/g 鮮重 )= 淀粉酶總活性 -α-淀粉酶活性 

=[5.375×(A4-A3 + 0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W

（2）按照蛋白質(zhì)含量計(jì)算

單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活力單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）= 淀粉酶總活性 -α-淀粉酶活性 

=[0.5375×(A4-A3 + 0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr

（3）血清（漿） 等液體樣本中 β-淀粉酶活性計(jì)算

單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生 1mg 還原糖定義為 1 個(gè)酶活性單位。

β-淀粉酶活性（mg/min/mL） = 淀粉酶總活性 -α-淀粉酶活性

=0.5375×(A4-A3 + 0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)

5： 總淀粉酶稀釋倍數(shù)；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V  樣：加入反應(yīng)體系中樣本體 積，0.25 mL；V 樣總：提取液總體積， 10 mL；  Cpr ：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本 質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，5min。