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脂肪酶活性試劑盒說明書(分光光度法)

貨號(hào)：LE-1-139

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

LPS 又稱甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和單酯）。LPS 廣泛的存在于各種生物中。血清中 LPS 的異常增高常見于胰腺炎和胰腺癌。

測定原理：

LPS 催化油酯水解成脂肪酸，利用銅皂法測定脂肪酸生成速率， 即可計(jì)算 LPS 活性。

自備儀器和用品：

研缽、臺(tái)式離心機(jī)、震蕩混勻器、可見分光光度計(jì)、1mL 玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、甲苯 100mL、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 14mL×1 瓶，4℃保存 。每次使用前用震蕩混勻器劇烈震蕩 20min。

試劑三：甲苯 100mL×1 瓶，4℃保存（自備）。 

試劑四：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 10μL×1 瓶， 10 μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃保存 。臨用前加入 3.168 mL 甲苯， 充分溶解。

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1： 5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。 12000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）： 試劑一體積（mL）為 500~1000： 1  的比例（建 議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 12000g，4℃,離心 10min， 取上清置于冰上待測。

3、血清等液體:  直接檢測。

LPS 測定操作：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 710 nm， 蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一和試劑二置于 37℃水浴預(yù)熱 30min 以上。

3、在 5mL EP 管中依次加入下列試劑

37℃振蕩反應(yīng) 10 min

37℃振蕩反應(yīng) 10 min 后 ，8000g，25℃,離心 10min ，取上清液

37℃振蕩反應(yīng) 5 min 后 ，靜置 5min，取 800μL 上層液加入 1  mL 玻璃比色皿，于 710nm 處測定吸光值。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。 

LPS 活性計(jì)算公式：

1、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 LPS 活性

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘水解橄欖油生成 1μmol 脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol/min/mg prot) = [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

=16×[(A 測定管－A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘水解橄欖油生成 1μmol 脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol/min/g  鮮重) = [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

= 16×[(A 測定管－A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]÷W

（3）按照細(xì)菌或者細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘水解橄欖油生成 1μmol 脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol /min/10⁴ cell) = [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]×V 反總 ÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T

= 16×[(A 測定管－A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]÷細(xì)胞數(shù)量

2、血清等液體 LPS 活性

活性單位定義：37℃中每毫升血清每分鐘水解橄欖油生成 1μmol 脂肪酸為一個(gè)酶活單位。

LPS (μmol /min/mL) = [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管－A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]×V 反總÷V 樣÷T

= 16×[(A 測定管－A 空白管)÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管- A 空白管）]

C 標(biāo)準(zhǔn)品：10 μmol/mL；V 反總：反應(yīng)總體積，2mL；V 樣：反應(yīng)中加入樣本體積，0.125mL； V  樣總：加入提取液體積， 1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度， mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間， 10 min。