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貨號：LE-1-150

正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯C3位點甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動植物的組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞傳遞、生長發(fā)育等方面具有重要作用。

測定原理

磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對硝基苯酚，在410nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見分光光度計、1mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 55mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體 20mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g離心 30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后于4℃，10000g 離心5min，取全部上清于4℃、100000g 離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL 試劑一。

3、血清：直接測定。

測定操作

酶活計算公式

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =0.0191x-0.0103，R²=0.9991

1、按照蛋白濃度計算

酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T= 125.5×（△A+0.0103）÷ Cpr

2、按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC 活性（nmol/min/g）=（△A+0.0103）÷0.0191×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W) ÷T= 125.5×（△A+0.0103）÷ W

3、按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活性定義：每10⁴個細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC活性（nmol/min/10⁴cell）=（△A+0.0103）÷0.0191×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量) ÷T= 125.5×（△A+0.0103）÷細(xì)胞數(shù)量

4、按照液體體積計算

酶活性定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯酚所需的酶量為一個酶活力單位。

PLC 活性（nmol/min/mL）=（△A+0.0103）÷0.0191×V 反總÷V 樣÷T= 125.5×（△A+0.0103）

V 反總：反應(yīng)總體積，1mL；V 樣：加入樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min