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總巰基測定試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-175

正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

生物體內(nèi)巰基主要包括谷胱甘肽巰基和蛋白質(zhì)巰基。前者不僅能夠修復(fù)氧化損傷的蛋白質(zhì)， 而且參與活性氧清除，后者對于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象具有重要作用。通過測定總巰基含量和 GSH 含量，能夠間接測定蛋白質(zhì)巰基含量。

測定原理

巰基基團(tuán)與 5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在 412nm 處有最大吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品

天平、研缽、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一：液體 40 mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 2 mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣品的制備：

1、按照組織質(zhì)量（g）：水體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 蒸餾水）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 8000g ，4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2、血清，培養(yǎng)液：稀釋 5 倍后測定，可取 0.1mL 樣本，加入 0.4mL 蒸餾水，混勻，置冰上 待測。

操作步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至 412nm ，雙蒸水調(diào)零。

2、操作表

在 1mL 玻璃比色皿中加入如下試劑

計(jì)算公式

總巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =3.6222 x- 0.0037 ，R² = 1 ，x 為標(biāo)品濃度，單位 μmol/mL ，y 為吸光度ΔA。

1、組織：

（1）按樣本重量計(jì)算

總巰基含量(μmol/g  鮮重）=(ΔA+0.0037） ÷3.6222 ×V 樣總÷W 

=0.276× (ΔA+0.0037） ÷W

（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算

總巰基含量(μmol/mg prot）=(ΔA+0.0037） ÷3.6222×V 樣總÷Cpr

=0.276×(ΔA+0.0037） ÷Cpr

2、血清、培養(yǎng)液：

總巰基含量(μmol/L）= (ΔA+0.0037） ÷3.6222×5×10³ 

= 1380×(ΔA+0.0037）

V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g  ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5 ：血清，培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù)；10³ ：1mmol/L=10³μmol/ L

試劑盒最低檢出限為 10 μmol/L。