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谷氨酰胺酶活性測定試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-316

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

GLS 催化谷氨酰胺水解成 L-谷氨酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶 活性。

需自備儀器和用品：

臺式離心機、可見分光光度計、水浴鍋、1mL  玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和蒸 餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 60mL×1 瓶，4  ℃保存；

試劑二：粉劑×2 瓶，4  ℃避光保存；臨用前每瓶加入 12.5mL 蒸餾水充分溶解待用，現(xiàn)配現(xiàn)用；

試劑三：液體 30 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑四：液體 10 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑五：液體 6 mL×1 瓶，常溫保存；

試劑六：液體6 mL×1瓶，常溫避光保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量 （104 個）：試劑一體積（mL）為 500~1000 ：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 試 劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）； 8000g4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min ，取上清，置冰上待測。

2 、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 420nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣品測定（在 EP 中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴 1  小時

混勻，8000 g ，25℃離心 10 min；取上清液，在 EP 管中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min ，420nm 處讀取吸光值 A ，計算 ΔA=A 測定管-A 對照管。對照管只需要做一管。

注意：

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A 測定管-A 對照管）若出現(xiàn)負值，可能是酶活性較低，可將反應時間 1h 延長到2h，相應的在計算公式中除以 2。 

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y =3.8488x +0.0057，R² = 0.9983；；x 為標準品濃度(μmol/mL）， y 為吸光值 A。

1、血清（漿）GLS 活性

單位定義：每 mL 血清（漿）每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。 

GLS（nmol /min /mL）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷V 樣÷T×1000

= 181.8×(ΔA -0.0057)

2、組織、細菌或細胞 GLS 活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每 mg 蛋白質(zhì)每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000

= 181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每 g 組織每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol/min/g  鮮重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000

= 181.8×(ΔA -0.0057)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS（nmol/min/10⁴ cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反總÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T×1000 

=0.3637×(ΔA-0.0057)

V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，60min；V 反總：反應體系總體積，1.05mL； V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.025mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量， g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬; 1000 ，μmol 到 nmol 換算系數(shù)。