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山梨醇脫氫酶（SDH）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-116

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

SDH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脫氫生成果糖，是調(diào)控生物體內(nèi)山梨醇含量的關(guān)健酶之一。

測(cè)定原理：

SDH催化山梨醇脫氫生成果糖，同時(shí)還原NAD⁺生成NADH，測(cè)定340nm吸光度增加速率可以計(jì)算SDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存；臨用前每瓶加入15mL蒸餾水，用不完的試劑仍4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入15mL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

將上述試劑按順序加1 mL玻璃比色皿中，加樣本的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄 20 秒時(shí)的初始吸光度A1和2分20秒時(shí)的吸光度A2，計(jì)算 ΔA=A2-A1。

SDH 活性計(jì)算：

1、血清（漿）SDH 活力的計(jì)算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1688×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T

=1688×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1688×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

SDH（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T

=3.376×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.05×10 ^-3 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。