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α-半乳糖苷酶 (α-GAL）試劑盒說明書（分光光度法）

貨號：LE-1-109

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

α-GAL (EC 3.2.1.22)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能專一地催化 α 半乳糖  苷鍵的水解，主要參與棉子糖、水蘇糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL  對于植物種子的萌發(fā)至關(guān)重要，種子萌發(fā)初期，其催化產(chǎn)生的 D-半乳糖通過糖酵解途徑迅  速轉(zhuǎn)化和消耗，為種子的萌發(fā)提供最初的能量來源 ，后期則主要參與細(xì)胞壁儲藏多糖水解。 

測定原理：

α-GAL 分解對-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通過測定吸光值升高速率來計(jì)算 α-GAL 活性。

自備用品：

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、 水浴鍋、可調(diào)式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶， -20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試 劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量  （10⁴ 個）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min

充分混勻，400nm 處測定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測定-A 對照。每個測定管需設(shè)一個對照管。

α-GAL 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y =0.00543x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/min /g 鮮重) ＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GAL 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T 

=0.123×(ΔA +0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V 樣總：加 入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì) 菌總數(shù)，500 萬；T：反應(yīng)時間，30min。