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β-半乳糖苷酶 (β-GAL）試劑盒說(shuō)明書(shū)（分光光度法）

貨號(hào)：LE-1-110

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

β-GAL(EC 3.2.1.23)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，能夠催化β半乳糖苷化合 物中β半乳糖苷鍵水解，此外還具有轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用 。β-GAL不僅可為植物的快速生長(zhǎng)釋 放儲(chǔ)存的能量，還能在正常的多糖代謝、細(xì)胞壁組分代謝以及衰老時(shí)細(xì)胞壁降解過(guò)程中催化 多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖殘基的水解，釋放自由的半乳糖。

測(cè)定原理：

β-GAL 分解對(duì)-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰， 通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算 β-GAL 活性。

自備用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000： 1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提  取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織： 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1 ：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿。 15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、培養(yǎng)液等液體樣本：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min

充分混勻，400nm 處測(cè)定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

β-GAL 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為 y =0.00543x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。

1、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。 

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每 g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/min /g 鮮重) ＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027) ÷W

3、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/min /10⁴ cell)=[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T 

=0.123×(ΔA +0.0027)

4、按液體體積計(jì)算：

單位的定義：每 mL 液體樣本每分鐘產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。

β-GAL 活力(nmol/min /mL) ＝[(ΔA+0.0027)÷0.00543×V 反總]÷V 樣÷T 

=61.39×(ΔA+0.0027)

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05mL；V 樣總：加 入提取液體積， 1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì) 菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。